基于临床肿瘤标本的胃癌转移模型建立

目的建立基于临床肿瘤标本的胃癌转移模型,为胃癌的转移研究提供个体化动物模型。方法将胃癌新鲜的手术标本移植到裸鼠皮下,建立胃癌患者异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型。进一步通过手术将皮下瘤组织原位移植到裸鼠胃部肌层,连续观察裸鼠的体征状态,通过近红外荧光活体成像技术检测肿瘤转移的发生。解剖荷瘤小鼠,将肺部转移灶进一步移植裸鼠皮下获得实体瘤。HE染色观察原发瘤与转移瘤的结构特征,(short tandem repeat) STR分析原发瘤和转移瘤的遗传特性。PCR-Array分析转移瘤和原发瘤中转移相关基因的表达。结果成功建立胃癌PDX模型,移植瘤组织结构与患者保持基本一致;通过胃部原位移植发现编号C19751的小鼠发生肺和肝的转移。其中肺转移灶皮下移植后获得了实体瘤,STR分析显示原发瘤保持了与肺转移瘤一致的遗传特征。PCR-Array结果显示,与原发瘤相比,转移瘤中CXCL12,IGF1和MMP2基因表达均显著上调。结论利用临床肿瘤标本成功建立胃癌转移模型,为胃癌转移研究提供了良好的个体化模型。     

RNAi沉默SDF-1基因对人胃癌裸鼠原位移植瘤生物学行为的影响及机制

目的:探讨RNAi技术沉默基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)对人胃癌裸鼠原位移植瘤生物学行为的影响及可能机制。方法:利用RNAi-SDF-1细胞及对照组细胞建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤,Western Blot检测裸鼠皮下移植瘤SDF-1蛋白表达情况。利用裸鼠皮下移植瘤建立其原位移植瘤模型,8周后处死裸鼠解剖尸体,检测原位移植瘤生长、凋亡及远处脏器转移情况。Western Blot检测SDF-1沉默对通路蛋白Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB以及侵袭转移相关基因E-cadherin、MMP-7表达的影响。结果:成功建立RNAi-SDF-1裸鼠原位移植瘤模型。与空白及阴性对照组比较,RNAi-SDF-1组裸鼠原位移植瘤生长缓慢,体积与质量均明显降低,差异有统计学意义(P0.01)。流式细胞术结果显示,RNAi-SDF-1组肿瘤细胞凋亡率明显高于空白及阴性对照组(P0.01)。尸体解剖结果显示,RNAi-SDF-1组肿瘤腹腔淋巴结及肝脏转移率明显低于空白及阴性对照组(P0.05)。Western Blot结果显示,与空白及阴性对照组比较,RNAi-SDF-1组肿瘤组织中Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB、MMP-7表达水平明显降低,E-cadherin表达水平明显升高(P0.01)。结论:RNAi-SDF-1能够有效抑制人胃癌SGC7901细胞裸鼠原位移植瘤的生长,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制其腹腔淋巴结、肝脏转移,其机制可能与抑制PI3K-Akt、NF-κB信号通路及MMP-7的表达并上调E-cadherin的表达相关。     

GFP标记的肺癌细胞生长和转移的在体荧光成像

目的:利用稳定表达GFP的人高转移肺巨细胞癌细胞株95D,在体观察肿瘤的生长和淋巴结转移情况.方法:利用逆转录病毒感染人高转移肺巨细胞癌细胞株95D,经过G418筛选获得稳定表达GFP的细胞株.接种裸鼠皮下,成瘤后使用Nikon公司SMZ1000 P-FLA型荧光体视显微镜观察皮下原发肿瘤病灶及转移淋巴结.结果:使用逆转录病毒感染,可以获得稳定表达高强度GFP的肺癌细胞株,且生物学行为无明显改变.接种至裸鼠皮下后,2周左右成瘤,皮下肿瘤原发病灶在荧光体视镜下可清晰观察到肿瘤侵犯范围及周边血管生长情况.切开皮肤,可以观察到表达的GFP的转移淋巴结.结论:GFP标记人高转移肺巨细胞癌细胞株95D,建立裸鼠移植瘤模型,能更方便的观察肿瘤的生长、侵润和转移,为研究肿瘤的生长转移机制打下基础.     

人胰腺癌裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和超声成像比较

目的利用荧光素酶基因标记的人胰腺癌细胞株Capan-2建立胰腺癌裸鼠移植模型,评价生物发光和小动物超声成像在移植瘤模型建立中的作用。方法将表达荧光素酶基因的真核表达载体转入人胰腺癌细胞Capan-2,将1×106人胰腺癌细胞悬液分别接种于裸鼠胰腺和右后肢皮下,使其成瘤。生物发光成像和小动物超声成像系统观察肿瘤的生长情况。结果肿瘤细胞原位移植成功率为75%,皮下移植成功率为100%。生物发光成像系统在肿瘤细胞原位接种第7天,可以观察到肿瘤发光;小动物超声成像系统在肿瘤细胞皮下接种第7天,可以测量肿瘤的大小,但在肿瘤细胞原位接种的第7天不能测量肿瘤的大小。另外肿瘤细胞在裸鼠皮下生长的速度比原位生长速度快3倍左右。结论生物发光成像系统更适用于肿瘤早期监测,为深入研究胰腺癌的发生发展、侵袭转移机制提供理想工具。     

活体荧光成像对裸鼠肝癌细胞系MHCC97-H原位移植模型的动态量化分析

目的:利用生物自发光的裸鼠肝癌原位移植模型,以活体荧光成像技术对肝癌的生长和转移情况进行动态、量化分析.方法:将稳定转染了荧光素酶(luciferase)基因的人肝癌细胞株MHCC97-H-LUC细胞,移植至裸鼠肝脏包膜下,每周利用活体荧光成像系统对裸鼠体内移植瘤的生长部位和范围进行成像,测量肿瘤细胞生物发光量,动态观察肝癌细胞在裸鼠体内的肿瘤数量、生长速度和转移情况.结果:建立可稳定表达荧光素酶的人肝癌细胞株MHCC97-H-LUC并用于进行生物自发光的裸鼠原位移植模型;利用活体荧光成像系统对裸鼠体内的移植瘤成像,见发光部位由肝脏向腹腔扩散,发光量随时间呈指数级增长;病理学观察证实肿瘤细胞长.结论:利用活体荧光成像技术的动态量化分析可灵敏、准确地监测裸鼠肝癌原位移植模型中肿瘤细胞的生长及转移情况,为肿瘤发生、生长、转移机制及对抗肿瘤生长和转移的体内研究提供了科学的量化手段.     

人胃粘液腺癌裸鼠移植瘤株的建立及其生物学特性的研究

将手术切除的原发性人胃癌新鲜组织移植于BALB/c裸鼠皮下获得成功,并已传至15代。建立的人胃粘液腺癌裸鼠移植瘤株(GC-916)具有移植成功率高,带瘤时间长的特点。总移植成活率99％,生长潜伏期14天,荷瘤裸鼠最长存活时间为160天,平均带瘤存活时间为89天。经组织学、组织化学、免疫病理学和超微结构观察,证实裸鼠移植瘤保持了原发人体胃癌的结构和功能,并具有表达突变型P_(53)蛋白及产生癌胚抗原的特性。该移植瘤株的建立为进一步研究人胃癌的基础理论和临床治疗提供了较理想的实验动物模型。     

癌症靶向基因-病毒ZD55-XAF1抗肝癌移植瘤的生长及其安全性研究

目的:探讨溶瘤腺病毒(ZD55-gene)作为载体携带外源抗癌基因(XAF1)抗肝癌移植瘤的生长及其安全性。方法:抽提溶瘤腺病毒ZD55-XAF1的基因组DNA,PCR扩增鉴定病毒;细菌平板培养和支原体检测试剂盒检测细胞有无细菌、支原体污染;通过荷瘤小鼠动物实验,观察溶瘤腺病毒ZD55-XAF1对肝癌移植瘤生长的抑制、小鼠的临床反应指标、血清肝毒性指标、各脏器组织中的病毒残留分布及病理切片观察。结果:细胞培养过程无细菌和支原体污染;较对照组,受试小鼠血清肝酶AST活性上升(P0.05),而ALT和ALP活性基本无变化(P0.05);PCR检测各脏器均有病毒基因组DNA存在;HE染色显示受试小鼠各脏器具有不同程度的损伤,病毒处理对肿瘤细胞具有明显的杀伤效果,而受试小鼠的临床反应并无明显异常。结论:溶瘤腺病毒ZD55-XAF1能够抑制肿瘤生长,杀死肿瘤细胞,对小鼠血清肝酶活性影响较小而对各脏器有不同程度的轻微损伤,作为癌症基因治疗载体有潜在的应用价值但其安全性还有待提高。     

荧光素酶标记人胃癌细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的建立荧光素酶标记人胃癌原位异种移植模型。方法将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入人胃癌MGC803细胞,建立稳定表达荧光素酶的细胞,将其接种裸鼠胃壁浆膜下,建立胃癌裸鼠原位肿瘤模型。用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并进行小动物超声影像和病理学分析。结果裸鼠原位成瘤率为100%,活体荧光成像观察发现在接种第7天,就可以观察到肿瘤发光。21 d后肿瘤进入对数生长期,28 d后肿瘤出现明显坏死,平均荧光光子数呈现下降趋势。超声成像发现小鼠胃部有直径为8.39 mm,面积为28.92 mm2瘤块。结论荧光素酶标记可以实时监测原位异种移植人胃癌生长状况。     

胰腺癌原位种植瘤中VEGF-C的器官差异表达和作用

目的 研究胰腺癌裸鼠原位种植瘤自发性淋巴结转移模型中VEGF-C表达的器官差异,以及VEGF-C反义寡核苷酸对不同生长部位胰腺癌细胞生长、凋亡能力的影响。方法 建立人胰腺癌细胞株PANC-1裸鼠原位种植瘤自发性淋巴结转移模型,分离、原代培养原发灶和自发性淋巴结转移灶中的胰腺癌细胞,并应用荧光定量PCR、MTT、流式细胞术检测VEGF-C反义寡核苷酸转染对原发胰腺癌细胞和淋巴结转移的胰腺癌细胞各自生长特性、凋亡能力的影响。结果 淋巴结转移胰腺癌细胞VEGF-C的mRNA表达水平显著高于原发灶胰腺癌细胞（P〈0.05）。VEGF-C反义核苷酸抑制胰腺癌细胞VEGF-C的表达后,淋巴结转移灶中胰腺癌细胞生长抑制率、凋亡率均显著提高（P〈0.01）,而原发灶中胰腺癌细胞无明显影响（P〉0.05）。结论 VEGF-C反义寡核苷酸能显著抑制淋巴结转移灶中胰腺癌细胞生长、促进凋亡,但对原发灶胰腺癌细胞无影响;VEGF-C基因的表达和作用存在器官差异性。     

胸腔原位种植与经左心室注射建立肺癌脑转移动物模型的比较

目的为研究肺癌脑转移机制提供一种可靠的造模方法。方法 18只BALB/c nude裸鼠随机分为2组,分别经胸腔原位种植与经左心室注射的方法,接种处于对数期生长的人肺腺癌PC-9细胞(1×106/0.1 m L),接种后观察裸鼠状态,在裸鼠出现严重恶液质时处死。解剖裸鼠,观察肺、脑、肝、肾转移情况;病理取材、HE染色观察。结果胸腔原位种植组:3周后,第4、6、9号裸鼠可见胸壁瘤结凸起形成,渐增大;裸鼠于第4~6周开始出现体重减轻,并逐渐出现恶液质,分别于第5~7周处死。开胸后见:胸腔广泛灰白色肿瘤结节、团块形成,双侧肋骨、胸膜、脊柱多发种植灶,双肺被侵蚀压缩,颜色苍白,形态改变。HE染色见:肺表面广泛种植瘤形成,与正常肺组织分界清楚;仅6号裸鼠出现脑转移。经左心室注射组:裸鼠于第3周开始出现体重下降,并逐渐出现恶液质,全部裸鼠于第4周处死。开胸后:除11、18号裸鼠胸壁见2~3个散在瘤结分布(直径约1~3 mm),其余胸腔视野正常;肺组织轮廓清楚,未见瘤结生成。HE染色见:9只裸鼠均出现大小不一的多发脑转移灶。胸腔原位种植组:脑转移率为11.1%;经左心室注射组:脑转移率为100%。结论经左心室注射建立肺癌脑转移动物模型的方法,较胸腔原位种植的方法保证了更高的脑转移率。     

Tumour susceptibility to innate and adaptive immunotherapy changes during tumour maturation

Immunotherapy of tumours using T cells expanded in vitro has met with mixed clinical success suggesting that a greater understanding of tumour/T-cell interaction is required. We used a HPV16E7 oncoprotein-based mouse tumour model to study this further. In this study, we demonstrate that a HPV16E7 tumour passes through at least three stages of immune susceptibility over time. At the earliest time point, infusion of intravenous immune cells fails to control tumour growth although the same cells given subcutaneously at the tumour site are effective. In a second stage, the tumour becomes resistant to subcutaneous infusion of cells but is now susceptible to both adjuvant activated and HPV16E7-specific immune cells transferred intravenously. In the last phase, the tumour is susceptible to intravenous transfer of HPV16E7-specific cells, but not adjuvant-activated immune cells. The requirement for IFN-gamma and perforin also changes with each stage of tumour development. Our data suggest that effective adoptive T-cell therapy of tumour will need to be matched with the stage of tumour development.     

MMTV-Wnt-1转基因小鼠作为高发乳腺癌动物模型的观察

目的　观察MMTV Wnt 1转基因小鼠的乳腺癌发病情况及病理学变化规律。方法　观察MMTV Wnt 1转基因小鼠肿瘤发生情况 ,并采用原位移植将瘤组织置于裸鼠皮下 ,通过组织病理学切片来观察MMTV Wnt 1阳性转基因小鼠和移植鼠的病理学变化。结果　MMTV Wnt 1转基因小鼠最早从 7周龄开始出现乳腺瘤 ,发瘤鼠剖检可见脾、肝有不同程度的肿大 ,其他器官无明显病变 ;病理组织学检查发现发瘤鼠各脏器有不同程度的病变 ,但未出现肿瘤转移。将瘤组织移植裸鼠后 ,肿瘤可在裸鼠皮下生长 ,移植肿瘤病理学形态与原发瘤一致 ,未出现转移。结论　实验结果验证MMTV Wnt 1转基因小鼠可稳定自发乳腺肿瘤 ,可作为研究乳腺癌的良好的动物模型     

A color-coded orthotopic nude-mouse treatment model of brain-metastatic paralyzing spinal cord cancer that induces angiogenesis and neurogenesis

Objective: Cancer of the spinal cord is highly malignant and often leads to paralysis and death. A realistic mouse model would be an important benefit for the better understanding and treatment of spinal cord glioma.
Materials and methods: To develop an imageable, patient-like model of this disease, U87 human glioma tumour fragments (expressing red fluorescent protein), were transplanted by surgical orthotopic implantation into the spinal cord of nontransgenic nude mice or transgenic nude mice expressing nestin-driven green fluorescent protein (ND-GFP). In ND-GFP mice, GFP is expressed in nascent blood vessels and neural stem cells. The animals were treated with temozolomide or vehicle control.
Results: The intramedullary spinal cord tumour grew at the primary site, caused hind-limb paralysis and also metastasized to the brain. Temozolomide inhibited tumour growth ( P  < 0.01) and prevented metastasis, as well as prevented paralysis in four mice and delayed paralysis in two mice of the six tested ( P  = 0.005). In the ND-GFP-expressing host, ND-GFP cells staining positively for neuronal class III-β-tubulin or CD31, surrounded the tumour. These results suggest that the tumour stimulated both neurogenesis and angiogenesis, respectively.
Conclusion: A patient-like model of spinal cord glioma was thus developed, which can be used for the discovery of new agents, including those that inhibit invasion and metastasis of the disease as well as those that prevent paralysis.     

Establishment of a Patient-Derived Orthotopic Xenograft (PDOX) Model of HER-2-Positive Cervical Cancer Expressing the Clinical Metastatic Pattern

Squamous cell carcinoma of the cervix, highly prevalent in the developing world, is often metastatic and treatment resistant with no standard treatment protocol. Our laboratory pioneered the patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model with the technique of surgical orthotopic implantation (SOI). Unlike subcutaneous transplant patient-derived xenograft (PDX) models, PDOX models metastasize. Most importantly, the metastasis pattern correlates to the patient. In the present report, we describe the development of a PDOX model of HER-2-positive cervical cancer. Metastasis after SOI in nude mice included peritoneal dissemination, liver metastasis, lung metastasis as well as lymph node metastasis reflecting the metastatic pattern in the donor patient. Metastasis was detected in 4 of 6 nude mice with primary tumors. Primary tumors and metastases in the nude mice had histological structures similar to the original tumor and were stained by an anti-HER-2 antibody in the same pattern as the patient’s cancer. The metastatic pattern, histology and HER-2 tumor expression of the patient were thus preserved in the PDOX model. In contrast, subcutaneous transplantation of the patient’s cervical tumors resulted in primary growth but not metastasis.     

绿色荧光裸鼠的建立和验证

目的建立系统性表达绿色荧光蛋白的裸鼠,接种人源肺癌细胞验证该模型是否具有免疫缺陷性,并观察双色荧光的成像效果。方法利用系统性表达绿色荧光蛋白的C57BL/6J小鼠与BALB/C裸小鼠多代杂交和互交,建立稳定表达绿色荧光蛋白的裸鼠。大体解剖观察胸腺生长情况,整体和器官荧光成像验证绿色荧光蛋白的表达情况。以2×106/只的剂量对其皮下腋下接种表达红色荧光蛋白的人类A549肺癌细胞（RFP-A549）,通过观测肿瘤生长来验证模型的免疫缺陷性。同时,利用红色荧光标记的肿瘤和绿色宿主鼠,对双色的整体成像效果进行观测。结果构建出系统性表达绿色荧光蛋白的裸鼠,大体解剖可见胸腺缺失。在激发光的激发下,绿色荧光裸鼠全身发出清晰的绿色荧光,脑、心脏、肺脏、肝脏、肾脏,肠胃及胰腺等主要器官可见明显绿色荧光。接种RFP-A549细胞后,成瘤率达到100%,整体动物荧光成像表现出清晰的双色。结论本研究构建出的绿色荧光裸鼠,动物整体可以清晰地表达绿色荧光并具有免疫缺陷性     

Continuous intravenous infusion in athymic (nude) rats: an animal model for evaluating the efficacy of anti-cancer agents

The athymic (nude) rat (rnu/rnu) has been used for a number of years in research into various human tumours involving xenotransplantation. We now report the validation of a continuous intravenous infusion method in nude rats using a tail cuff tether, which enables the study of the efficacy of novel anti-cancer materials in this mutant strain, using intravenous infusion and with no restriction of the animals or of the tumour implantation sites by jackets. Ten animals each had a cannula surgically implanted into the vena cava via the femoral vein and exteriorized via a tail cuff. Animals were housed singly in conventional cages following surgery. Following a recovery period of 5 days all animals were continuously infused with physiological saline at an infusion rate of 0.5 ml/h for a further 37 days. Body weights and food consumption were recorded weekly. Blood samples were taken approximately 14 days post-surgery and analysed for haematology and clinical chemistry parameters. All animals were successfully cannulated, and no unexpected adverse clinical signs were noted during the recovery period and the 37 days of infusion. The results demonstrate that it is possible to surgically cannulate the femoral vein of athymic (nude) rats and infuse them in conventional cages for a period of up to 37 days with minimal adverse effects. The minimal restraint required provides benefits both to the animal and to the conduct of studies such as assessment of tumour growth in the absence of a jacket. Recent work has demonstrated that the same techniques can be successfully applied to the nude mouse.     

肺癌转移瘤动物模型的建立

目的通过尾静脉注射,建立一种符合临床特征的肺腺癌转移瘤动物模型,为下一步的肺腺癌转移机制的研究提供可靠的实验造模方法。方法取对数生长期的A549细胞,11只SPF级、4~6周龄BALB/c裸鼠,分别以1×106个细胞/只注射入裸鼠尾静脉。接种后每天观察小鼠状态。分别于接种肿瘤细胞后第4、5、6、7周随机处死2只,余3只小鼠处于濒死状态时处死。解剖小鼠,观察肺部有无转移、转移结节的数目及全身其他器官的转移情况,并做病理取材,HE染色观察。结果注射过程中小鼠均存活。未处死的3只分别于第11、13、14周出现恶液质。第4周肺部未见转移结节;第5周出现镜下肺部转移结节;第6周肉眼可见肺部转移结节;第7周转移结节数增多;第11周出现纵隔淋巴结转移。第11、13、14周出现肺部结构大量破坏,弥漫性的肿瘤细胞浸润,出现淋巴结浸润,病理证实为腺癌。结论通过尾静脉注射A549细胞可以成功建立人肺腺癌转移瘤模型。     

不同方式构建A20鼠B细胞淋巴瘤动物模型

目的探索多种方式构建A20鼠B细胞淋巴瘤动物模型及不同方式造模成瘤的特征。方法鼠源性B细胞淋巴瘤细胞株A20经皮下、尾静脉、脾脏和腹腔接种于同源BALB/c小鼠或先接种裸鼠成瘤后组织块移植BALB/c小鼠,观察动物成瘤时间、成瘤率、成瘤部位;取肿瘤组织和动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察其组织学特点。结果BALB/c鼠皮下注2×10^6组、2×10^7组和裸鼠瘤组织移植BALB/c小鼠组成瘤率皆为100%,成瘤时间分别为（15.29±3.2）d（、7.0±0.82）d和（6.29±0.49）d。BALB/c小鼠尾静脉注射2×106组、2×107组、脾脏注射组、腹腔注射组成瘤率分别为71.4%、100%、71.4%、14.3%,成瘤时间分别为（76.8±12.0）d、（26.1±7.99）d、（32.6±5.99）d和27 d。尾静脉成瘤部位播及肝脏、脾脏、胰腺、肾脏、食道、胃、肠、肠系膜、脑、淋巴结、骨、子宫、肌肉等多脏器和组织。BALB/c鼠A20成瘤组织学类似人弥漫大B细胞淋巴瘤。结论成功构建A20皮下移植瘤模型、血行播散性模型,为利用有免疫功能动物进行B淋巴瘤相关研究提供了实验平台。     

人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型的建立

目的建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型。方法将1例人卵巢癌组织移植裸鼠,建立人卵巢癌裸鼠原代移植实体瘤模型的基础上,再将实体瘤皮下移植、实体瘤原位移植、实体瘤细胞移植裸鼠。观察裸鼠实体瘤生长和转移情况,称量其体重、子宫卵巢重、瘤重及瘤的大小,并作病理、电镜、染色体检查。结果成功地建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型,并已传至第18代,传代移植成功率100％,组织学和超微结构形态均证明该实体瘤保留了原人卵巢癌特征,有人卵巢癌染色体特征,并出现肝、脾转移。结论本研究建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型与人相似,通过18代传代和实验观察方法稳定可靠。为人卵巢癌的研究提供了理想的动物模型。