HrpN基因在毕赤酵母中的克隆表达与活性检测

将hrpN基因插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA的醇氧化酶（AOX1）启动子下游,构建重组表达载体pPIC6aA-hrpN,经电击转化毕赤酵母菌株X-33和杀稻瘟素筛选,得到高效分泌表达harpin Ea的毕赤酵母菌株。经初步纯化、SDS-PAGE分析和生物测定,结果显示,诱导96h的此重组菌大量表达harpinEa表达产物具有诱导烟草超敏感反应的功能,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinEa。     

合成耐高温α-淀粉酶PFA在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

PFA是来源于Pyrococcus furious的一种耐高温α-淀粉酶,为了使PFA能够在巴斯德毕赤酵母中高效表达,根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性对PFA的基因序列进行密码子优化,人工合成耐高温淀粉酶PFA基因pfa,并连接到巴斯德毕赤酵母中表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-pfa。重组质粒线性化后转化到巴斯德毕赤酵母菌株GS115中,重组菌株在摇瓶中用甲醇诱导表达,分泌表达酶活最高为220U／L。     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

人防御素6基因的克隆、亚克隆及在酵母中的分泌表达

探讨人防御素6(HD-6)在毕赤酵母中表达的可行性,为进一步研究HD6的功能提供理论依据和实验基础。采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与毕赤酵母表达载体pPICZαA重组,以得到重组的HD-6酵母表达载体pPICZαA/HD-6,并进行琼脂糖电泳和测序鉴定。再将构建好的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA/HD-6经SacⅠ线性化后,应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态中,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDSPAGE分析重组HD-6的表达。从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和测序结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内;线性化的重组质粒pPICZαA/HD-6成功转化进入毕赤酵母感受态中,PCR鉴定结果与预期相符;蛋白电泳证实重组HD-6在酵母中获得分泌表达。提示重组HD-6可以在毕赤酵母中实现分泌表达。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突糖蛋白S。方法:根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物,并在5'引物和3'引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,2.2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体,再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞,G418筛选鉴定阳性重组子,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测诱导后上清。结果:对pPIC9k-S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因;重组酵母菌诱导表达后,SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量约为82×103,且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论:利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒(河北分离株)纤突糖蛋白S。     

昆虫神经毒素BjαIT的表达及杀虫活性

根据毕赤酵母Pichia pastoris密码子偏爱性,不改变毒素蛋白质一级结构,设计合成了昆虫神经毒素BjαIT基因,并分别克隆至大肠杆菌Escherichia coli融合表达载体pPET30-a(+)和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物利用镍亲和层析柱纯化,纯化产物用于制备抗血清和活性测试。采用斑点杂交,筛选得到了较高水平分泌表达重组BjαIT的酵母转化子,摇瓶条件下,毒素表达量最大可达约20 mg/L。大肠杆菌BjαIT表达产物对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis和德国小蠊Blattela germanica没有活性,但酵母表达产物经注射东亚飞蝗和德国小蠊表现出杀虫活性。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达

将宇佐美曲霉E001的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPXY-NII,将其经SalⅠ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和KM71,xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXGL98(Mut+)和PXKL29(Muts)。该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXGL98与PXKL29培养物上清液中的酶活力分别可达1156.92 U/mL和1646.03 U/mL。     

猪PR-39抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达

[目的]在毕赤酵母中表达抗菌肽PR-39基因,获得有抗菌活性的PR-39。[方法]根据酵母和猪密码子偏好性,对其密码子进行优化改造。将经SOE-PCR获得的PR-39基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组载体pPIC9K-PR-39。经SacⅠ线性化电击转化毕赤酵母GS115,取阳性克隆进行髙拷贝转化子筛选和诱导表达。[结果]pPIC9K-PR-39重组质粒构建成功,pPIC9K-PR-39菌株发酵产物检测结果对DH5α大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果。[结论]获得了PR-39基因的重组酵母,并用毕赤酵母系统成功地分泌表达了具有明显抗菌活性的抗菌肽PR-39。     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液,酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上,较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。     

重叠延伸PCR法克隆人脂联素基因及其在毕赤酵母中表达

利用重叠延伸PCR法克隆出人脂联素基因, 连接至克隆载体pGEM-T中, 转化大肠杆菌DH5a, 通过测序对其进行序列分析后, 进一步构建毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN, 通过电击法转化毕赤酵母GS115, 转化的重组酵母菌用甲醇诱导外源基因表达。经PCR、Southern blotting鉴定, 获得了重组毕赤酵母菌株; 经甲醇诱导人脂联素基因表达, Western blotting杂交鉴定证明人脂联素基因已经在毕赤酵母中成功表达。结果表明重叠延伸PCR法准确方便克隆出人脂联素基因, 在30oC, 1%甲醇诱导48 h, 人脂联素基因在巴斯德毕赤酵母中的表达最佳。     

拟南芥AtDAD1超量表达植株对H2O2抗性的研究

构建拟南芥AtDAD1超量表达载体,以农杆菌介导的方法转化拟南芥哥伦比亚生态型,比较AtDAD1超量表达植株和野生型植株表现型的差异,以及两者对H₂O₂抗性的不同。实验显示,AtDAD1转基因拟南芥生长较野生型拟南芥更为强壮,对高浓度H₂O₂有较强的耐受力。测定两者糖含量,发现AtDAD1转基因拟南芥叶片糖的含量明显高于野生型拟南芥叶片。以上结果表明,AtDAD1基因可能参与植物生长发育,并可能在拟南芥抵抗凋亡的过程中发挥重要的作用。     

红肉猕猴桃DFR基因的克隆及表达分析

利用葡萄(Vitis vinifera)果实的DFR-cDNA序列搜索猕猴桃(Actinidia Lindl.)EST数据库,拼接所有与该cDNA相似片段成contig并借此设计引物,分离出红肉猕猴桃(A.chinensis var.rufopulpa)中DFR的两个克隆(AcDFR1和AcDFR2)的片段。在此基础上利用5′RACE和3′RACE技术,分别克隆到具有完整阅读框的AcDFR1(1264 bp)和靠近3′端的部分AcDFR2序列(880 bp)。AcDFR1与茶DFR-cDNA(Camellia sinensis)相似达84%,且AcDFR1与非洲菊变种(Gerbera hybrida var.regina)的氨基酸序列相似达80%。据DFR聚类分析,AcDFR1与AcDFR2蛋白类型上差异显著。实时定量PCR分析表明,AcDFR1在‘金魁'(A.chinensis var.deliciosa‘Jinkui')中表达很高,AcDFR1和AcDFR2在‘金农'(A.chinensis var.chinensis‘Jinnong')与‘红阳'(A.chinensis var.chinensis‘Hongyang')中较低,且在果实发育后期(大约花后90～120 d)均有所升高,二者可能参与了红肉猕猴桃中花青素的积累,而在绿肉猕猴桃‘金魁'与黄肉猕猴桃‘金农'中,AcDFR1可能还参与了类黄酮代谢过程中的上游分支途径。     

从光合作用特性看铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的竞争优势

通过测定净光合放氧速率,研究了温度、光照和pH对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和玫瑰拟衣藻(Chloromonas rosae)光合作用的影响。两种藻的光合放氧速率都随着温度的升高而加快,在10~35℃范围内,铜绿微囊藻净光合放氧速率随温度升高而直线上升,其最适温度高于35℃,而当温度高于30℃后玫瑰拟衣藻的净光合放氧速率迅速下降;两种微藻的光合放氧速率-光强变化曲线有所不同,铜绿微囊藻光饱和点在500μmol·m^-2·s^-1附近,光强达到900μmol·m^-2·s^-1时仍无光抑制现象发生,玫瑰拟衣藻光饱和点在630μmol·m^-2·s^-1附近,当光强进一步升高,光合放氧速率开始下降;铜绿微囊藻最适pH值是10.0,在pH值6.5~11.5范围内,光合放氧都很活跃,变化幅度不大,玫瑰拟衣藻最适pH值7.0,偏酸或偏碱光合放氧都迅速地下降,pH高于10.0出现了负值。比较两种藻的光合作用特性,铜绿微囊藻光合作用具有3个特点:(1)适应温度范围宽,对高温具有良好的适应性,并且光合作用随温度的升高显著提高;(2)光饱和点低,光合作用活性高,能在弱光环境中高效地进行光合作用,并且抗强光伤害;(3)对pH变化具有超强的适应能力,在中性和碱性环境中,都能进行活跃的光合作用。铜绿微囊藻在光能利用、温度和pH适应性方面的特点,可以使其快速生长繁殖,积累大量的生物量,在与其它藻类的竞争中占据显著的优势。     

杂交后代中转基因小麦外源1Ax1基因的遗传

高分子量麦谷蛋白亚基1Ax1基因是决定小麦加工品质的主效基因之一,在小麦胚乳中增加1Ax1基因的表达量可以提高其加工品质,这对于小麦的品质改良具有重要意义。采用外源1Ax1基因超量表达的转基因小麦‘B102-1-2’为父本,常规小麦品种‘鄂麦12’和‘川89-107’为母本进行杂交试验。采用SDS-PAGE技术检测并分析各组合亲本、F₁代、F₂代的HMW-GS组成,从而研究转基因小麦‘B102-1-2’中外源品质基因1Ax1表达的遗传规律。研究结果表明:外源基因有效地整合进入主栽小麦的基因组中,并且正确表达,在F₂代中表现出15:1的分离比,遵循孟德尔遗传模式,这对于杂交育种策略的选择制订具有指导意义。     

牡山羊草Aegilops juvenalis Puroindoline b基因的克隆

Puroindoline a(Pina)和puroindoline b(Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因。根据已报道的小麦Pinb基因的保守序列,设计合成了一对特异性引物,对六倍体牡山羊草Aegilops juvenalis(UUMMDD)的基因组DNA和胚乳cDNA进行Pinb基因扩增、克隆和序列测定,发现了两个新型Pinb等位基因Pinb-allele-1和Pinb-allele-2。该基因全长360 bp,编码119个氨基酸残基。它编码的蛋白和麦类作物Puroindoline B(PinB)的成熟蛋白有非常高的同源性,具有麦类作物PinB蛋白所特有的WPTKWWK的色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。与软粒小麦cv.Capitole的Pinb-D1a相比较,其核苷酸同源性为93.1%、93.3%,氨基酸同源性为90.8%、92.4%。Pinb-allele-1和Pinb-allele-2分别含有11和9个氨基酸变异位点。RT-PCR证实了Pinb-allele-2基因在籽粒胚乳中的表达。Southern Blot分析结果表明,牡山羊草中含有两个拷贝的Pinb基因,其中包含着与小麦差异较大的籽粒硬度控制基因。     

拟南芥网状突变体E-210基因精细定位

通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变与遗传分析,从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中筛选到一株隐性单基因控制的网状突变体E-210。该突变体植株生长缓慢,叶脉呈绿色,叶肉呈黄色。通过透射电镜观察,发现野生型植株和突变植株在叶绿体结构上差异不大,猜测该突变体E-210基因与叶绿体的发育可能没有直接关系,而很可能同叶绿素或叶绿体的生物合成有关。通过图位克隆的方法,将该突变体的突变基因定位在第5条染色体上的MRB17和MBG8-5的分子标记之间,精确到87.130kb。对MRB17和MBG8-5的分子标记之间的22个基因进行了分析,预测突变体E-210基因可能是At5g54770,编码THI1,即噻唑合成酶。     

中华结缕草(Zoysia sinica Hance)组织培养和再生植株研究

以中华结缕草(Zoysiasinica Hance)成熟种子为外植体在附加2.5mg/L2,4-D、0.25mg/L6-BA和1～2mg/LVB₁的改良MS培养基(MS_m)上愈伤组织的诱导率最高为43.0%。愈伤组织的最佳继代培养基为MSm附加0.1mg/L6-BA和2.0mg/L2,4-D。在无生长调节物质的MS培养基(MS₀)上,外观呈白色到淡黄色、含有密实颗粒的愈伤组织再生率为30%～60%。     

富贵草杀灭钉螺效应研究

以富贵草(Pachysandra terminalis Sieb.et Zucc.)(以下简称PT)为实验材料,采用开放式浸杀法研究其植物原粉及提取物(PT-Ⅰ)对钉螺的杀灭效果和对鱼类的毒性作用。结果表明PT原粉浓度为17.5 mg/L时,钉螺72 h死亡率为93.4%,120 h死亡率达100.0%;其24、72、120、168 h的LC50分别为42.28、7.20、4.20、3.17 mg/L。PT原粉浓度为75.0 mg/L时,经168 h鱼死亡率为0。使用浓度为35.0、17.5、8.75、4.38 mg/L的PT原粉,分别浸泡1、2、18、42 h时,抑制钉螺上爬率均达到100%。原粉经提取分离得到PT-Ⅰ组分,以1.40 mg/L的PT-Ⅰ组分分别浸杀钉螺24、48、72、96、120 h,钉螺死亡率分别为36.7%、73.3%、96.7%、96.7%、100.0%。表明PT具有很好的杀灭钉螺、抑制钉螺上爬效果,且对鱼毒性较低,是一种较有研究价值的灭螺植物。     

柚子(Citrus grandis Osbeck)S-like核酸酶基因CgSL1的分离与特征分析

从柚子(CitrusgrandisOsbeck)2个自交不亲和品种溪蜜柚和度尾蜜柚的花柱中克隆出一个类似S核酸酶基因CgSL1(C.grandisS-likeRNase),它的cDNA序列全长1074bp,编码297个氨基酸。通过与其它植物S-like核酸酶和S核酸酶氨基酸序列进行比较,发现CgSL1类似于S-like核酸酶,与拟南芥中的RNS2一致性为62.5%。对CgSL1的表达分析表明该基因在花柱、花药、叶片不同器官以及花柱的不同发育阶段均有表达,且在花柱中的表达随衰老增强,由此推测它可能与衰老有关。     

Fe3+对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生长及荧光特性的影响

为探求适宜雨生红球藻CG-06株生长的Fe³⁺浓度和Fe³⁺对藻细胞荧光特性的影响,以BBM为基础培养基,选用EDTA-FeNa(Ⅲ)为Fe³⁺源,设置0、1.79、8.95、17.9、35.8、71.6μmol·L^-16种Fe³⁺浓度梯度,实验测定藻的生长并分析不同Fe³⁺对藻细胞叶绿素荧光和77 K低温荧光等的影响。结果表明:适合雨生红球藻CG-06株生长的Fe³⁺浓度为8.95μmol·L^-1,Fe³⁺浓度较高时,雨生红球藻的生长受到抑制,Fe³⁺浓度低于1·79μmol.L^-1将产生低铁限制。W alz-PAM测定数据显示,在铁不足或高铁抑制条件下,雨生红球藻光系统Ⅱ活性明显下降,开放态的反应中心数目减少,光合作用受到抑制。77 K低温荧光光谱显示,在铁不足或高铁抑制条件下,710 nm荧光峰降低,684 nm和694 nm荧光峰相对增强,说明能量在两个光系统分配上发生变化,能量更多的分配给光系统Ⅱ,限制了光系统Ⅰ的活性。在高铁抑制条件下,CP₄₇蛋白荧光峰降低,CP₄₃蛋白荧光峰增强,推测存在D₁蛋白降解。