电子自旋共振波谱技术研究不同pH值对二棕榈酰磷脂酸脂质体相变性质的影响

本文用电子自旋共振(ESR)波谱技术研究了不同pH值对酸性磷脂二棕榈酰磷脂酸(DPPA)脂质体相变性质的影响。结果表明:DPPA脂质体随pH值的增加其相变温度降低。通过对测试条件的选择和波谱参数的测量,TEMPO标记的DPPA脂质体在HEPES溶液中ESR谱不出现疏水峰的原因,是由于仪器分辨率不够以及自旋标记探针TEMPO在DPPA脂质体脂双层疏水相中的超精细偶合常数Ao和各向同性go因子与它们在HEPES溶液中的值相近。     

细菌视紫红质蛋白的赖氨酸和丝氨酸残基在其膜环境中的自旋标记研究

用化学修饰和自旋标记ESR技术研究了bR中丝氨酸和赖氨酸残基的构象,结果表明PH对bR分子构象的影响是很明显的,在酸性条件下带有自旋探针的丝氨酸(Ⅰ-bR)和赖氨酸(Ⅱ-bR)的ESR波谱参数迥然不同,这与丝氨酸和赖氨酸残基位点微环境中的电荷效应有关.顺磁增宽剂能猝灭膜表面的自由基,而剩余的强固定化ESR信号显示出bR分子内部的‘刚性’构象.用2%Triton X—100处理可大大增加bR分子的‘柔性’,其ESR波谱特征与bR分子失去部分α螺旋结构和改变了它的某些运动方式有关.     

天花粉凝集素的荧光光谱研究

天花粉凝集素在天然状态下荧光发射峰位于３３２ｎｍ处,以丙烯酰胺,ＫＩ及ＣｓＣ１等淬灭剂研究ＴＫＬ分子中Ｔｒｐ残基的微环境,发现只有丙烯酰胺能淬灭ＴＫＬ分子Ｔｒｐ的荧光,同此推断大部分的Ｔｒｐ残基位于ＴＫＬ分子内部,其荧光不易为Ｉ＾－或Ｃｓ＾＋接近而淬灭。疏水探针ＴＮＳ能够检测到ＴＫＬ中疏水微区的存在,并且这一疏水微区亦不同于ＴＫＬ的半乳糖结合位点,ＴＫＬ中不存在金属离子的结合部位。     

超氧化物歧化酶的自旋标记研究

本文应用对-SH基特异性结合的自旋标记物对Cu_2Zn_2-SOD进行自旋标记研究,进一步观察了电离辐射对-SH基部位的影响,实验结果:(1)自旋标记后的Cu_2Zn_2-SOD表现出典型的弱固定化的ESR波谱信号特征。标记对Cu_2Zn_2-SOD的UV谱无明显影响。这表明该游离-SH基是位于酶蛋白分子的相对表层而不是包埋在疏水内部。(2)标记保温后立即取样及保温后17小时取样测酶活力,发现与未标记酶的活力相同。这表明该-SH基与酶的催化活性无直接关系。(3)在10—100Krad γ-射线照射下,酶活性及ESR信号幅度均随照射剂量增加而下降,两者之间有一定的相关性。     

紫膜表面电荷数的测量

以CAT₁₂为自旋探针,用ESR自旋标记法测量了不同表面pH时酰化前后紫膜表面负电荷密度,以酰化所屏蔽的表面电荷数为标准,计算了表面pH4-11时单位菌紫质紫膜两侧的总负电荷数.结果表明:表面pH5-9时为9,表面pH≥10及表面pH < 5时增大.结果有力支持了膜表面5个二价阳离子结合位点的模型.     

白芷培养细胞外钙调素结合蛋白的胶体金电镜定位研究

利用胶体金标记技术制备了具有生物活性的植物CaM-BSA-gold探针,并用此探针建立了白芷愈伤组织培养细胞胞外钙调素结合蛋白(CaMBPs)的透射电镜标记方法。标记结果显示,在1mmol/L Ca~(2 )存在下,用EGTA洗涤过的白芷愈伤组织培养细胞壁表面有金颗粒分布,而分别在含有EGTA、TFP、过量未标记的CaM、CaM抗体存在的情况下,用金标CaM探针进行标记.以及用金标羊抗兔抗体替代金标CaM探针进行标记的各对照组,细胞壁表面金颗粒则消失,说明白芷愈伤组织培养细胞壁表面存在着CaM结合位点或CaMBPs。     

热锻炼能提高菜豆细胞可溶性蛋白,SOD,膜ATP酶和质子泵在体外的…

以菜豆为实验材料,研究了蛋白质分子和生物膜在体外热稳定性的变化和原因,实验结果表明：热锻炼可增加细胞的耐热性,并赋予ＳＯＤ、膜ＡＴＰ酶和生物膜质子在体外的热稳定性;通过对可溶性蛋白热变性后的浊度分析和用ＡＮＳ荧光探针探测蛋白质的结构变化,发现蛋白热变性的原因是疏水区的暴露和相互轩聚,＾３５Ｓ－Ｍｅｔ标记分析和二维电泳谱揭示,热锻炼诱导合成的热激蛋白具有阻止蛋白质热变性和生物膜热破坏的功能。     

生物素标记的6种cDNA探针检测S180及其克隆细胞株mRNA的表达

目的检测S180及其克隆细胞株S1B11及S2D9mRNA的表达,对这些细胞株进行识别和质量控制.方法用生物素标记的6种cDNA探针,细胞玻片原位杂交的方法检测细胞中mRNA的表达.结果北京市肿瘤研究所(肿瘤所)保存的S180与生物素标记的P16、c-fos、c-myc及c-jun探针杂交阳性,克隆细胞株S1B11与c-fos及c-jun探针杂交阳性,克隆细胞株S2D9与c-fos、c-myc及c-jun探针杂交阳性.结论肿瘤所S180及其2株克隆细胞中mRNA的表达不同,c-myc基因的表达与否可以把S1B11及S2D9克隆细胞区别开;细胞株致瘤性与癌基因表达有关.     

热锻炼能提高菜豆细胞可溶性蛋白、SOD、膜ATP酶和质子泵在体外的热稳定性

以菜豆为实验材料,研究了蛋白质分子和生物膜在体外热稳定性的变化和原因。实验结果表明：热锻炼可增加细胞的耐热性,并赋予ＳＯＤ、膜ＡＴＰ酶和生物膜质子泵在体外的热稳定性;通过对可溶性蛋白热变性后的浊度分析和用ＡＮＳ荧光探针探测蛋白质的结构变化,发现蛋白热变性的原因是疏水区的暴露和分子相互团聚,~（３５）Ｓ－Ｍｅｔ标记分析和二维电泳谱揭示,热锻炼诱导合成的热激蛋白具有阻止蛋白质热变性和生物膜热破坏的功能。     

天花粉蛋白小结构域N端同源片段的溶液构象,T18肽的圆二色性…

应用圆二色性,内源荧光和疏水荧光探针法进一步研究Ｔ１８肽的溶液构象及其相互转化,发现Ｔ１８肽在水溶液中为β折叠结构,且在高浓度（〉１ｍｇ／ｍｌ）时形成疏水聚合物,Ｌｙｓ１５和Ｉｌｅ３－Ｉｌｅ４是形成β折叠疏水簇的关键因素,并讨论了蛋白质链和溶剂环境对肽段二级结构的调制作用。     

辣根过氧化物酶同功酶B、C构象的毫微秒萤光研究

本文利用1,8-ANS作萤光探针,通过毫微秒萤光技术研究了辣根过氧化物酶的同功酶B、C(文中以HRP(B)、HRP(C)表示)的构象,测得ANS和脱辅基HRP(B)、HRP(C)复合物的萤光寿命分别为19.6毫微秒和17.7毫微秒(即10~(-9)秒,用ns表示),从而证实同功酶B、C分子中确有较强的疏水区域,且这个疏水区域就在分子中血红素(heme)的结合区附近。通过萤光寿命的测定和研究,我们发现,HRP(B)、HRP(C)分子中的疏水区域的疏水性比牛血红蛋白分子中的要弱,比肌红蛋白分子中的要强;HRP(B)的疏水区的疏水性要略强于HRP(C)的。我们还研究了溶液的pH条件及不同浓度的脲对该疏水区构象的影响,观察到一个颇有意思的现象,即和牛血红蛋白一样,1Mal.的脲使血红素结合区的疏水性增强,1Mal.以上浓度的脲却使该区域疏水性减弱。在不同的pH条件下,血红素结合区域的疏水性亦有变化,其中,pH7条件下该区的疏水性最强。     

CaMBP-10单克隆抗体的制备及CaMBP-10在豌豆器官中的表达检测

用电泳纯钙调素结合蛋白BP 10 (CaMBP 10 )免疫小鼠 ,制备单克隆抗体 (McAb) .用MEP(mercapto ethtyl pyridine)HyperCel疏水层析柱从细胞培养上清中纯化并获得单克隆抗体 ,同时测定了抗体 抗原反应的基本特性 .此单克隆抗体具有较高纯度、特异性和亲和力 .亲和常数 (Kaff)为1 2 6× 10 9(mol L) -1,此抗体和CaM在空间上以相同或相近的位点与CaMBP 10相结合 .以胶体金标记的抗体为探针 ,研究CaMBP 10在豌豆幼叶、成熟叶、茎尖、茎、根等不同器官的分布特征 ,并与胶体金标记CaM的结合情况相对照 .结果显示 ,CaMBP 10在植物中的分布特点与文献报道的CaM的分布特点相一致 ,提示CaMBP 10可能是在蛋白水平上对CaM进行区域化和可用性调节     

利用生物条形码技术对蓝舌病毒VP7蛋白进行微量检测

目的：建立高灵敏检测蓝舌病毒VP7蛋白的生物条形码检测方法。方法：制备VP7蛋白的多抗及特异DNA链标记的金纳米颗粒探针（NP）和VP7蛋白单抗标记的磁性微球探针（MMP）,形成MMP-VP7蛋白-NP三明治复合物后,再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过PCR或芯片检测方法鉴定释放的DNA链,确定VP7蛋白的存在。结果：建立了蓝舌病毒VP7蛋白的生物条形码检测体系,检测灵敏度可达10fg/mL,为常规ELISA检测的106倍。结论：为发展高灵敏度的蓝舌病毒生物条形码检测试剂盒鉴定了基础。     

藻胆蛋白荧光探针及其标记

藻胆蛋白是一系列新型的荧光标记探针,具有优良的荧光特性,以藻胆蛋白荧光探针标记抗体还可用于血清可溶性抗原（或抗体）的荧光免疫检测,其标记方法可分为直接法和间接法。结合藻胆蛋白的特点,研究藻胆蛋白的标记方法有助于提高荧光免疫检测的灵敏度。     

PCR法制备地高辛标记探针改良PCR-Select Differential Screening试剂盒

目的:探讨采用地高辛(digoxin,DIG)标记探针替代PCR-Select differential screening试剂盒中同位素标记探针的方法.方法:抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)所分离的差异表达序列转移至硝酸纤维素膜,以PCR法掺入DIG-11-dUTP制备探针,按DIG标记探针常规操作进行杂交显色,杂交阳性结果采用reverseNorthern blot再度杂交验证.结果:应用DIG标记探针改良PCR-Select Differential Screening试剂盒所得到的阳性结果经reverse Northern blot验证符合率达到90%.结论:DIG标记探针改良PCR-Select differential screening试剂盒在避免了放射污染同时具备很高的特异性,完全可以替代同位素标记探针.     

GFP质控芯片的初步研究

目的：建立一种质量控制芯片来监测样品标记、杂交和检测过程中的失误。方法：针对GFP基因设计的4条60mer寡核苷酸探针和1条阳性对照探针polv（U）与流感寡核苷酸探针一起打印在DAKO玻片上,并构建了GFP基因的克隆载体和体外表达载体,将从这两种重组载体上获得的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）基因的ILNA、DNA片段和人的全血样品中的DNA用限制性显示技术（Restriction Display technology,RD）扩增标记,将标记的样品和荧光标记的通用引物U分别与芯片杂交、检测,并对扫描的结果进行统计分析。结果：GFP探针与相应的样品杂交时出现阳性信号,阳性对照探针在所有的杂交中均出现阳性信号,而空白对照则未检测荧光信号。结论：建立的质控芯片具有较好的敏感性和特异性,可以用于基因芯片中的质量监控。     

一种切口平移法制备生物素标记核酸探针的简便方法

用切口平移法制备生物素标记的核酸探针,其所用试剂质量稳定、可靠,标记重复性好,且制备的探针易长期保存.我们在制备人IL-6 cDNA等基因探针的实验中,对常规的切口平移法制备生物素标记核酸探针的方法作了简化改进,省略了分离步骤,经斑点杂交试验证明效果良好.     

白芷培养细胞外钙调素结合蛋白的胶体金电镜定位研究

利用胶体金标主民技术制备了具有生物活性的植物Ｃａｍ－ＢＡＳ－ｇｏｌｄ探针,并用此探针建立了白芷愈伤组织培养细胞下调素结合蛋白的透射电镜标 记方法。标记结果显示,在１ｍｍｏｌ／ＬＣａ＾２＋存在下,用ＥＧＴＡ洗涤过的白芷愈伤组织培养细胞壁表面有金颗粒分布,而分别在含有ＥＧＴＡ、ＴＦＰ、过量未标记的ＣａＭ、ＣａＭ抗体存在的民政部下,用金示ＣａＭ探针进行标记,以及用的各对照组,细胞壁表面金颗粒则消失,说明     

光谱及分子模拟法对HSA和BSA与酪氨酸激酶抑制剂Imatinib相互作用的比较分析

研究一种酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）伊马替尼（imatinib, IMA）与人血清清蛋白（HSA）及牛血清清蛋白（BSA）的相互作用,比较分析HSA和BSA与IMA相互作用机制的差异. 模拟生理条件下,计算机模拟技术结合荧光光谱和紫外光谱法,研究IMA与蛋白质的作用机制. 分子模建IMA与血清清蛋白的结合模型,表明伊马替尼与蛋白质的相互作用力为疏水作用力,兼有氢键作用. 光谱结果表明,IMA与HSA和BSA的相互作用表现为静态结合过程,结合强度较强,IMA与HSA和BSA分子的结合距离r值较小,说明发生了能量转移现象. IMA对HSA和BSA的结构域微区构象产生影响,使结合位域的疏水性发生改变. 荧光相图技术解析出IMA与HSA和BSA反应构象型态的变迁为“二态”模型. HSA与IMA相互作用的热力学参数表明,IMA与HSA之间是以疏水作用为主的分子间作用,而IMA与BSA之间的作用力为氢键和范德华力,兼有少量的疏水作用力. 光谱实验与计算机模拟结果基本一致,可为研究IMA与HSA和BSA相互作用本质提供一定参考.     

编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因在人睾丸组织表达的研究

抗人精子膜蛋白的单克隆抗体YWK-Ⅱ,能引起人精子凝集和抑制体外穿卵,并发现在睾丸组织中至少有4种形式的mRNA对应于YWK-Ⅱ抗原,可能是同一基因转录而不同方式剪切的产物.从人睾丸λgt10 5’Stretch cDNA文库中筛选,得到1个4kb大小的cDNA,命名为 C211.在 C211的 5’变异区和 3’相对稳定区中选择了2段.DNA分别作为转录探针的模板,5’端为943 bP和3’端为1.5kb的片段,将以上二个片段与含SP6和T7启动子的PGEM3Z载体进行重组,采用体外转录,地高辛标记的方法,分别合成2,tRNA探针,对人睾丸组织进行原位杂交.人睾丸YWK-ⅡC211基因片段地高辛(Dig)标记的5’端和3’端Antisense cRNA探针均与支持细胞质中的mRNA杂交,证明YWK-Ⅱ抗原蛋白在Sertoli细胞中合成,并又镶嵌在生精细胞膜上,最终定位于精子头部赤道极.