血红素蛋白疏水性的毫微秒荧光的研究

应用毫微秒荧光技术结合荧光探针方法研究牛血红蛋白、豆血红蛋白和辣根过氧化物酶同功酶等血红素蛋白辅基结合区域的疏水特性和构象变化,过氧化物酶活性中心的疏水性,构象变化和活性的关系.     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究 Ⅴ.用萤光探针1,8-TNS对疏水区的初步研究

1,8-TNS与溶剂极性和粘度关系的研究,证明正如它们的位置异构物2,6-TNS一样具有萤光疏水探针的性能。我们用此探针比较研究了胰岛素、去B链羧端五肽胰岛素(DPI)、牛血浆白蛋白、溶菌酶、卵白蛋白的疏水表面性质。结果表明DPI和胰岛素相似,存在一个小而确定的疏水区。提示B链羧端五肽的去除并未严重改变其与受体结合有关的疏水面结构。在生理pH值其疏水面暴露较胰岛素略大。但其疏水面构象稳定性较胰岛素弱,随pH升高,分子局部构象可能发生扭动,疏水面构象遭到一定程度的破坏。总的来讲,DPI结构较胰岛素松散,稳定性亦下降。     

不同解折叠状态鸡心脱血红素细胞色素c分子的表面性质

脱血红素细胞色素ｃ的构象与其跨膜转运能力是密切相关的。鸡心脱血红素细胞色素ｃ具有较强的自发折叠的能力,在一定条件下可以得到不同解折叠状态的鸡心脱血红素细胞色素ｃ。本文利用疏水层析、与疏水探针１,８—ＡＮＳ的结合以及色氨酸与结合的ＡＮＳ之间的荧光共振能量转移,比较了不同解折叠状态的鸡心脱血红素细胞色素ｃ分子的表面性质。结果表明,部分折叠的鸡心脱血红素细胞色素ｃ分子获得了一种高度动态的结构,形成了动态的疏水核心;同时,它也具有较强的凝集倾向。这些性质与鸡心脱血红素细胞色素ｃ分子较强的自发折叠能力是一致的,为进一步分析鸡心脱血红素细胞色素ｃ分子的构象及其在跨膜转运过程中与脂的相互作用奠定了基础。     

生物膜能量偶联ATP酶的比较研究——Ⅰ.鼠肝线粒体内膜与ATP酶(F_1)的人工重组及ANS萤光探针与ATP酶的结合

本文报导了大鼠肝线粒体内膜ATP酶的析离和重组,以及膜对ATP酶的结构和功能的影响。用(1)胰蛋白酶-尿素、(2)硅钨酸盐和(3)枯草杆菌蛋白酶三种方法分别制备的去ATP酶(F_1)的线粒体内膜与可溶性的F_1重组后,完全恢复或部分恢复到天然线粒体内膜的ATP酶活力水平。寡霉素敏感性测定、ANS结合的发射萤光光谱测定、电镜负染标本观察和低温处理试验等都一致证明,ATP酶与膜重组后表现了一系列与天然膜相似的性质。ANS萤光探针与线粒体内膜结合的萤光增强效应主要在于ANS与ATP酶(F_1)的结合并与F_1的分子构象有密切关系。经胰蛋白酶-尿素处理去掉F_1的线粒体内膜基本上丧失了ANS的萤光增强效应。可溶性F_1经0℃处理2小时后,丧失酶水解活力的84%和ANS萤光增强效应的96.4%。F_1与膜结合后,则表现了对0℃低温的稳定性。结果提示,ANS可能与ATP酶分子的疏水微区相结合;ATP酶分子疏水结构的存在对于表现酶的水解活力和ANS的萤光增强效应是必要的条件;低温处理破坏了酶分子内的疏水结构;膜与ATP酶结合则有稳定酶分子的疏水结构和分子构象的作用。     

血红蛋白与一氧化氮的生物化学反应

血红蛋白(Hb)的血红素或HbβCys^98分别与一氧化氮(NO)形成铁亚硝酰血红蛋白[Hb(Fe^Ⅱ)NO]或S-亚硝基血红蛋白(SNO-Hb)。两种存在状态与Hb铁的氧化还原化学以及Hb构象有关。Hb分子内NO能从血红素转移至βCys^93巯基,调节NO的贮存与释放。     

毫微秒脉冲萤光计

本文描述了测量毫微秒数量级萤光寿命的仪器——毫微秒脉冲萤光计。它的光源——自由放电灯是我们自己研制的,它的脉宽短(约5ns)、光谱分布宽(2000～6000)、重复频率高(每秒钟数十千周)、光脉冲波形稳定(幅度变化小于百分之五),每次光脉冲可发出10~8～10~(11)个光子。用本仪器测定了一些化合物的萤光寿命,其结果与已发表的数据非常一致。     

毫微秒脉冲萤光计

本文描述了测量毫微秒数量级萤光寿命的仪器——毫微秒脉冲萤光计。它的光源——自由放电灯是我们自己研制的,它的脉宽短(约5ns)、光谱分布宽(2000～6000(?))、重复频率高(每秒钟数十千周)、光脉冲波形稳定(幅度变化小于百分之五),每次光脉冲可发出10~8～10~(11)个光子。用本仪器测定了一些化合物的萤光寿命,其结果与已发表的数据非常一致。     

去七肽胰岛素的分子动力学研究

本文用分子动力学的方法对去七肽胰岛素(DHPI)分子的构象进行了研究,首先用分子动力学方法对晶体胰岛素分子的构象能进行了优化,然后除去B链C端的最后七个残基(B24—B30),做分子动力学模拟,得到了DHPI的平衡构象和均方差波动。胰岛素分子的X射线晶体衍射结构和能量优化构象之间的均方根偏差为0.1;所得DHPI构象和胰岛素能量优化构象间C原子间的均方根偏差为1.8。变化最大的区域是A8—A10,A18—A21,B1—B41和B18—B23。     

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)研究进展

由于缺乏合适的HCV感染细胞模型,严重制约了HCV复制,特别是HCV复制的关键因子依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的研究.对HCV序列比较分析并通过异源表达证明NS5B是HCV复制的RdRp.NS5B C端疏水性氨基酸区域以及NS5B与细胞膜形成复合体等影响NS5B溶解性.在合适的反应条件下NS5B可以多种RNA分子为模板催化RNA复制,特别是能有效复制HCV全长(+)RNA.高浓度GTP激活HCV RdRp活性.NS5B N/C端缺失突变和保守性A、B、C区中的点突变影响RdRp活性,但D区345位精氨酸突变为赖氨酸时RdRp活性明显升高.HCV RdRp的发现及其功能研究为HCV药物研究提供了新型靶标.     

胍和脲溶液对氨基酰化酶活性和构象的影响

 本文研究了不同浓度盐酸胍和脲溶液对猪肾氨基酰化酶活性和构象的影响。研究结果表明,在低浓度的胍和脲溶液中(小于2mol/L),酶分子的整体构象变化的程度与活力变化的程度基本是平行的;而在高浓度的胍和脲溶液中(2mol/L以上),失活程度稍大于构象变化的程度。这些结果与分子量和亚基组成基本相同,但不含金属配基的肌酸激酶的结果,以及小分子量的胰凝乳蛋白酶和牛胰核糖核酸酶的结果相比较来看,可以认为配基锌离子的存在对酶分子的活性部位区域构象的稳定作用有一定的贡献,致使氨基酰化酶的活性部位的构象状态不象后三种酶那样脆弱。同时,我们还发现锌离子的存在对酶分子整体构象的稳定性上贡献很小。     

在甲醇酵母Pichia pastoris胞内表达有活性的辣根过氧化物酶

为了开辟在甲醇酵母 Pichia pastoris中表达 HRP的新途径 ,将编码成熟 HRP同功酶 C基因克隆到表达载体 p PIK3.5K中 .p PIK3.5KHRP转化 GS1 1 5后 ,用 PCR筛选阳性 P.pastoris重组株 ,并用甲醇进行诱导 . Western印迹杂交分析表明目标蛋白 (约为 38k D)能被天然 HRP的多克隆抗体所识别 ,因此活性辣根过氧化物酶已在 P.pastoris胞内表达 .筛选菌株中显示了明显的过氧化物酶活性 ,同时诱导过程中血红素和 Ca Cl2 的加入对过氧化物酶的活力影响不大     

“构象记忆”的辣根过氧化物酶的微水相共价固定化

本研究利用酶在微水溶剂中的"构象记忆"特性,以壳聚糖微球为载体,以辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)为研究对象,将HRP于活性构象下冻干"固定"后,在二氧六环:水=99:1(V/V)微水介质中与载体进行共价交联,同时与传统水介质中共价交联固定化的HRP进行比较。结果发现,两种介质中固定化HRP的最适温度都提高到60°C,最适pH均为6.5,而微水相中固定的酶活力损失较低,酶活比传统水相中固定的酶高6倍以上;70°C保温30min后,微水相中固定的酶保留75.42%的活力,而水相中固定的HRP仅存15.4%的活力;微水相中固定的HRP具有更好的操作稳定性和热稳定性,60°C下连续操作5次之后,微水相固定的HRP保留77.69%的酶活,而水相固定的HRP仅存16.67%的酶活;微水相中固定的HRP在苯酚的去除中表现得更具优势;微水相中共价交联制备的CS-HRP-SWCNTs/Au酶修饰电极对H2O2的响应信号比水相中共价固定的酶电极强2.5倍,灵敏度更高。本研究表明利用酶的"构象记忆"在微水介质中进行共价交联是固定化酶的一种可行方法,所制备的固定化酶具有更优良的性质。     

神经节苷脂GM3对重建Ca 2+ -ATP酶构象的调节

应用稳态荧光和纳秒时间分辨瞬态荧光技术,以不同性质猝灭剂探测了神经节苷脂GM3诱发的Ca ²⁺-ATP酶构象的变化.结果显示,GM3可使重建的Ca ²⁺-ATP酶蛋白内源荧光寿命明显延长;并且能不同程度地减弱离子性猝灭剂碘化钾(I^-)和脂溶性猝灭剂竹红菌乙素(HB)对Ca ²⁺-ATP酶色氨酸(Trp)内源荧光的猝灭程度.进一步用时间分辨荧光猝灭动力学分析,当体系中有GM3存在时,HB对该蛋白不同荧光寿命组分的Trp内源荧光猝灭的幅度减小.猝灭常数(K_sv)明显降低.说明GM3依靠其亲水糖链和疏水的神经酰胺链作用,不仅可以改变重建Ca ²⁺-ATP酶蛋白嵌于膜脂疏水区内部的构象,使位于膜脂疏水区不同部位的Trp残基更加趋向排列于亲水-疏水域界面;而且还使Ca ²⁺-ATP酶亲水-疏水结构域之间更趋接近,致使整个酶蛋白分子呈现较“紧凑”的构象,表达较高的酶活力.     

在不同物理化学条件下天花粉蛋白的圆二色性研究

用圆二色谱研究了天花粉蛋白在酸性和碱性溶液中的构象,并观察了在十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中天花粉蛋白分子构象的变化,用Chen,Yang与Martinez等人的方法计算了各种条件下天花粉蛋白二级结构含量.结果表明:在很宽广的pH范围内(从pH2到pH12)分子构象基本上是稳定的.但是,在强碱性条件下即pH>12(室温)或pH11.5(40℃)螺旋含量显著减少.在碱性条件下,于250nm附近出现一新的CD带,它的强度与离解的酪氨酸残基个数呈线性关系,说明这一新带主要是由离解的酪氨酸残基产生的.     

兔肌醛缩酶中色氨酸残基的分布及其作用

在不同条件下,用NBS修饰兔肌醛缩酶的色氮酸残基。pH4.0时测定到全酶分子的总色氨酸残基数为12,用邹氏图解法求得其中2个色氨酸残基为表现活性所必需。而在pH7.5条件下,仅鉴定出2个色氨酸残基。这些实验表明此2个色氨酸残基很可能就位于分子表面。此外,紫外光谱和萤光光谱指出,pH4.0时,NBS 引起酶构型的较大的变化,而在pH7.5时仅引起较轻微变化。这些结果认为:醛缩酶的四个亚基对整个分子构象的贡献是不完全相同的,同时醛缩酶整个分子也是不对称的。     

兔肌醛缩酶中色氨酸残基的分布及其作用

在不同条件下,用NBS修饰兔肌醛缩酶的色氨酸残基。pH4.0时测定到全酶分子的总色氨酸残基数为12,用邹氏图解法求得其中2个色氨酸残基为表现活性所必需。而在pH7.5条件下,仅鉴定出2个色氨酸残基。这些实验表明此2个色氨酸残基很可能就位于分子表面。此外,紫外光谱和萤光光谱指出,pH4.0时,NBS引起酶构型的较大的变化,而在pH7.5时仅引起较轻微变化。这些结果认为:醛缩酶的四个亚基对整个分子构象的贡献是不完全相同的,同时醛缩酶整个分子也是不对称的。     

氢气对辣根过氧化物酶活性的影响及其作用机制的研究

氢气具有广泛的生物学功能,但氢气发挥生物学效应的靶点仍存在争论。我们前期发现,氢气可以与乙酰胆碱酯酶(AChE)直接作用并提高其活性,提示酶分子可能是氢气的潜在作用靶点。除AChE外,氢气是否还可与其它酶分子相互作用目前尚未见报道。本研究目的是探索氢气对辣根过氧化物酶(HRP)活性的影响。采用荧光光谱和紫外光谱方法检测氢气对HRP活性的影响,并对氢分子作用机制进行了深入探索。研究结果表明,当氢气浓度在饱和状态(800μmol/L)和半饱和状态(400μmol/L)下,HRP酶活性分别提高了18.42%和5.44%;荧光光谱检测表明,氢气使HRP内源性氨基酸荧光强度增强了4.15%,色氨酸到血红素中心的距离由2.85 m缩短至2.69 nm,荧光量子产率由72.8%增加至73.4%;紫外光谱检测表明,氢气可使HRP转化为高价铁的HRP I状态速率降低,同时在间歇性紫外照射后,波长在红移至HRP I状态后存在蓝移现象。以上结果提示,氢气可能改变了HRP中的组氨酸、色氨酸及天冬氨酸的微环境,导致氢键网络重构,从而使反应过程中向血红素中心传递能量的效率增加,His42-Asn70之间氢键增强,酶活增强;同时,氢气可使"H_2O-H_2O_2"为桥梁的氢键网络式催化发生变化,降低HRP I的形成速率。本研究不仅进一步证实了酶分子可能是氢分子发挥生物学作用的潜在靶点,同时对氢分子调节HRP酶活性机制的探索,为氢分子作用机制研究提供了更多的线索。     

牛胰多肽(BPP)及去氧胆酸盐(DOC)与DMPC脂质体相互作用的激光拉曼光谱研究

本文报导用激光拉曼光谱技术研究牛胰多酞(BPP)和去氧胆酸盐(DOC)与DMPC脂质体的相互作用.结果表明,BPP与DMPC之间存在较强的疏水作用,从I_(2880cm)~(-1)/I_(2345cm)~(-1)强度比说明,BPP能使磷脂分子间协同作用加强,抑制由DOC所产生的磷脂分子间作用减弱.从C—C(?)动强度比I_(1998cm)~(-1)/I_((?)25cm)~(-1),说明BPP使磷脂分子内部gauche/trans构象比值下降,同时表现出抑制由DOC产生的guache/trans比值升高的作用.此外,BPP与DMPC作用后,磷脂头部基团外C—N伸缩振动波数向低波数向低波数方向从715cm~(-1)移至710cm~(-1),I_(715cm)~(-1)/I_(1295cm)~(-1)强度比值降低,提示BPP与DMPC之间除了有较强的疏水作用外,同间也存在静电相互作用.     

牛胰多肽(BPP)及去氧胆酸盐(DOC)与DMPC脂质体相互作用的激光拉曼光谱研究

本文报导用激光拉曼光谱技术研究牛胰多酞(BPP)和去氧胆酸盐(DOC)与DMPC脂质体的相互作用.结果表明,BPP与DMPC之间存在较强的疏水作用,从I_(2880cm)~(-1)/I_(2345cm)~(-1)强度比说明,BPP能使磷脂分子间协同作用加强,抑制由DOC所产生的磷脂分子间作用减弱.从C—C(?)动强度比I_(1998cm)~(-1)/I_((?)25cm)~(-1),说明BPP使磷脂分子内部gauche/trans构象比值下降,同时表现出抑制由DOC产生的guache/trans比值升高的作用.此外,BPP与DMPC作用后,磷脂头部基团外C—N伸缩振动波数向低波数向低波数方向从715cm~(-1)移至710cm~(-1),I_(715cm)~(-1)/I_(1295cm)~(-1)强度比值降低,提示BPP与DMPC之间除了有较强的疏水作用外,同间也存在静电相互作用.     

同功酶

同功酶是指一种酶的多种形式,它们在催化相同的反应时,对最佳反应条件如pH和底物浓度的要求方面有所区别,同功酶是由成双的多肽亚基构成的复杂蛋白质,例如,乳酸脱氢酶(LDH)是由A和B两种多肽亚基构成的四聚体,共有五个同功酶,可用符号