大麻状罗布麻的全基因组分析和SSR标记开发

大麻状罗布麻是重要的经济和生态作物,由于基因组数据匮乏和分子标记少而限制其遗传研究工作的开展。本研究利用Illumina测序平台对大麻状罗布麻的基因组大小进行测定,通过生物信息学方法对其基因组杂合度和重复序列等基本信息进行预估,并做了基因组的初步组装,在此基础上对其基因组序列进行了SSR查找。研究结果表明,总测序量为31.94 Gb,测序质量正常(Q20≥90%,Q30≥85%),与NCBI核苷酸数据库(NT)比对显示样本不存在外源污染;K-mer分析(K=17)结果显示,大麻状罗布麻基因组大小为239.02 Mbp,杂合率为0.56%,重复序列占全基因组比例为36.72%,初步预估大麻状罗布麻基因组为复杂基因组;采用K-mer=41进行基因组初步组装,共获得273336条contigs,N50为3838 bp,总长为222723253 bp,进一步将contigs进行连接、延长,组装得到224587条scaffolds,N50为6421 bp,总长为226378236 bp;此外,对基因组数据进行SSR分子遗传标记分析,共鉴定出117511个SSR,不同类型核苷酸重复差异较大,单核苷酸重复最多,六核苷酸重复最少。该研究为后续全基因组de novo测序及组装策略提供依据。     

新疆沙冬青基因组调查测序与基因组大小预测

新疆沙冬青是中国荒漠地区代表性常绿阔叶植物,属于第三纪孑遗植物。其极强的逆境耐受性受到了研究者的广泛关注,但由于缺乏基因组序列,分子生物学研究水平进展缓慢。本研究对新疆沙冬青进行了基因组调查测序,共得到65 Gb大小的双端测序数据。结合基于K-mer分析和流式细胞分析的方法,预测基因组大小、杂合率和GC含量等特征,估计基因组大小为770~787 Mb。测序数据拼接构建得到contigs的N50为684 bp,总读长为0.538 Gb;进一步组装后scaffolds的N50为12.09 kb,总读长为0.602 Gb。对拼接数据进行SSR分子标记预测,共得到151858个SSR,其中二核苷酸重复单元比例最高为56.39%,在二核苷酸重复单元中,AT/TA组成形式占多数。本研究首次报道了荒漠植物新疆沙冬青的基因组特征,为后续基因组学研究提供参考。     

濒危植物羊踯躅全基因组SSR标记开发与鉴定研究

该研究利用基于全基因组限制性酶切位点简化基因组测序技术（RAD seq技术）,开发濒危植物羊踯躅（Rhododendron molle G. Don）全基因组SSR标记,并对3个群体共63份羊踯躅材料进行验证鉴定,为进一步研究羊踯躅的遗传多样性和群体遗传结构以及保护利用提供技术支持。结果显示：（1）羊踯躅基因组测序获得原始数据7.653G bp,过滤后为7.513G bp;经组装发现,羊踯躅171.534 M bp的基因组分布在498 252 contigs中。（2）通过SSR检测,在11 961 SSR位点中获得了11 687对SSR分子标记,并且二核苷酸为基序的重复类型最丰富,达51.76%。（3）随机选取128对SSR标记在6个羊踯躅株系中进行PCR扩增,获得20对高多态性的SSR标记。（4）用所选的20对多态性SSR标记对3个群体共63份羊踯躅材料进行验证分析发现,这些多态性SSR标记位点的等位基因数为4~16个,期望杂合度（H_e）为0.489~0.908。 研究表明,羊踯躅的SSR丰度适中,且二核苷酸为羊踯躅中最丰富的重复序列,该实验进一步证明RAD seq技术是一种经济有效的基因测序方法,实验中开发的SSR引物将有助于进一步研究羊踯躅和其他近缘种的群体结构和多样性。     

濒危植物羊踯躅全基因组SSR标记开发与鉴定研究（英文）

该研究利用基于全基因组限制性酶切位点简化基因组测序技术(RAD-seq技术),开发濒危植物羊踯躅(Rhododendron molle G.Don)全基因组SSR标记,并对3个群体共63份羊踯躅材料进行验证鉴定,为进一步研究羊踯躅的遗传多样性和群体遗传结构以及保护利用提供技术支持。结果显示:(1)羊踯躅基因组测序获得原始数据7.653Gbp,过滤后为7.513Gbp;经组装发现,羊踯躅171.534Mbp的基因组分布在498 252contigs中。(2)通过SSR检测,在11 961SSR位点中获得了11 687对SSR分子标记,并且二核苷酸为基序的重复类型最丰富,达51.76%。(3)随机选取128对SSR标记在6个羊踯躅株系中进行PCR扩增,获得20对高多态性的SSR标记。(4)用所选的20对多态性SSR标记对3个群体共63份羊踯躅材料进行验证分析发现,这些多态性SSR标记位点的等位基因数为4~16个,期望杂合度(He)为0.489~0.908。研究表明,羊踯躅的SSR丰度适中,且二核苷酸为羊踯躅中最丰富的重复序列,该实验进一步证明RAD-seq技术是一种经济有效的基因测序方法,实验中开发的SSR引物将有助于进一步研究羊踯躅和其他近缘种的群体结构和多样性。     

亚麻EST序列中SSR标记的筛选

利用亚麻NCBI数据库中的7 941条亚麻EST序列进行SSR的筛选,共发现222个SSR,占整个EST数据库的2.73%,其中三核苷酸重复单元的EST-SSR占总SSR的72.1%,二核苷酸和四核苷酸二者出现的频率基本相近,分别占总SSR的14.4%和13.5%.AGAA是四核苷酸中的优势重复类型,占四核苷酸重复类型的67.67%.设计的21对EST-SSR引物中有18对在10个亚麻材料中有扩增产物,占设计引物的85%,有14对产物条带比较清晰并具有多态性.基于SSR标记进行聚类分析,可将10个亚麻材料划分为3个组.本研究建立的亚麻SSR标记,为亚麻遗传多样性鉴定、分子作图等研究提供了一种有效的分子标记系统.     

大豆SSR技术研究进展

微卫星DNA是重复单位少于 6个核苷酸的简单重复序列。在大部分真核细胞的基因组中有着广泛分布 ,呈孟德尔式遗传。以此为基础发展起来的SSR标记是一种共显性分子标记 ,遗传多态性丰富。本文着重介绍近年来SSR技术应用在大豆遗传图谱构建、基因研究、品种鉴定和分子标记辅助育种等方面取得的进展 ,并初步预测该方法在大豆研究中的发展方向。     

大豆SSR技术研究进展

微卫星DNA是重复单位少于6个核苷酸的简单重复序列。在大部分真核细胞的基因组中有着广泛分布,呈孟德尔式遗传。以此为基础发展起来的SSR标记是一种共显性分子标记,遗传多态性丰富。本文着重介绍近年来SSR技术应用在大豆遗传图谱构建、基因研究、品种鉴定和分子标记辅助育种等方面取得的进展,并初步预测该方法在大豆研究中的发展方向。     

基于转录组测序信息的水生植物莕菜SSR标记开发

利用软件MISA对水生植物莕菜转录组测序所获得的79536条EST序列进行分析,共检测出12319个EST-SSR位点。在莕菜的EST-SSR中,二核苷酸和三核苷酸重复单元是主导类型,分别占总SSR的57.31%和30.87%,其中AG/CT、AAG/CTT分别是二、三重复单元类型的优势重复基元,分别占总SSR的29.76%和8.66%。随机挑选了130对EST-SSR引物对莕菜两个居群进行遗传多样性检测,结果发现：78对引物能扩增出清晰可分辨的条带,其中37对能成功检测出多态性,引物多态率为 47.44%。这些多态性引物共检测出114个等位基因,每个位点2~6个,平均3.08个。观测杂合度（H_o）及预期杂合度（H_e）分别在0.229~1.000和0.351~0.756之间,多态信息含量PIC值在0.286~0.698之间,平均达0.495。以上研究结果表明,通过莕菜转录组测序产生的EST数据来开发SSR标记是一种简单而高效的途径,这些新的SSR分子标记为研究莕菜的居群遗传多样性及其遗传结构提供了工具。     

思茅松转录组SSR分析及标记开发

基于思茅松转录组测序数据进行其SSR标记开发,为丰富思茅松SSR数据库提供参考。采用MISA软件对思茅松59 636条Unigene进行SSR搜索,共获得3 745个SSR位点,分布频率为6.28%,平均11.36 kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以三核苷酸基序为主,其次是二核苷酸基序,所占比例分别为49%和24%,其主要重复单元分别为AGC/CTG和AT/TA。随机挑选224个位点进行引物设计及合成,琼脂糖凝胶检测发现其中29个位点具有多态性且效果良好,但仅12个位点符合SSR重复类型的倍数大小且扩增效率高于85%。利用这12对荧光标记引物,对2个居群42份样本进行遗传多样性分析,共检测到35个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.093 2-0.480 9,平均为0.306 9。4个位点为低度多态位点(0PIC0.25),8个位点为中度多态位点(0.25PIC0.5)。这12个标记可用于思茅松遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位及克隆等研究,旨为思茅松分子标记辅助育种及变异水平等研究提供技术支持。     

马铃薯甲虫基因组SSR位点分析及引物效率的验证

SSR作为一种微卫星分子标记方法,被广泛用于遗传多样性相关的研究,而SSR引物是否高效是影响整个实验结果的重要因素。本研究利用生物信息学手段,对马铃薯甲虫基因组数据进行分析,搜索基因组SSR位点,并设计引物和验证SSR引物的效率。最终在马铃薯甲虫基因组中共检测出SSR位点81 937个,且这些位点中以单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重复为主;从SSR位点的平均分布距离来看,单、三、四核苷酸重复在马铃薯甲虫基因组中平均分布距离较小,分别为2.21 kb、8.39 kb、36.21 kb。马铃薯甲虫基因组SSR位点中,优势基序总数为68 388个,比例高达83.46%,其中,单核苷酸以A/T重复基序占绝对优势,二核苷酸重复的SSR位点中,以AG/CT重复基序为主,三核苷酸重复的位点中,以AAT/ATT重复基序为主;在ClassⅠ长度的SSR位点中,以二核苷酸、三核苷酸重复的数量最多,比例高达82.32%;最后设计19对SSR引物测试效率,其中14对成功扩增条带,11对为多态性引物,其平均多态性条带6.27条。多态性引物的PIC值在0.375-0.794,平均值为0.600,大于平均值的引物为6对,占有效扩增引物的54.5%。研究表明,利用生物信息发掘SSR位点的方法简便高效,这为后续进一步利用SSR引物研究马铃薯甲虫的遗传多样性,及在其它昆虫中开发SSR引物开发奠定研究基础。     

油菜简单重复序列SSR(simple sequence repeat)研究进展

简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)是重复单元少于6个核苷酸重复序列,广泛分布于动植物基因组中,呈孟德尔遗传,已被作为一种理想的共显性标记应用于动植物遗传研究中。本文重点介绍了SSR分类、特点,及近几年来油菜SSR标记的开发和SSR技术在油菜基因定位、品种鉴定中的应用,并对SSR标记在油菜中的应用进行了探讨。     

印度血桐与中平树基因组调查及SSR分子标记分析

印度血桐与中平树是大戟科血桐属植物,该属植物具有多种药用价值,被广泛应用于民间医学中许多疾病的治疗,这两种植物种子中含有的神经酸也引起了研究者的高度关注。为确定适合印度血桐与中平树的全基因组测序研究策略,该研究采用二代高通量测序技术,结合生物信息学的方法首次测定了印度血桐与中平树的基因组大小、杂合率、重复率等基因组信息并初步分析了两种材料的SSR序列特征。结果表明:(1)印度血桐与中平树的基因组大小分别为986.84和946.23 M。(2)印度血桐与中平树的杂合率分别为0.75%和0.65%,重复序列比例分别为73.02%和71.5%。(3)通过对2种材料基因组序列的SSR特征分析,在印度血桐中共鉴定了4 499 185个SSR,在中平树中共鉴定了4 969 098个SSR。该研究结果为印度血桐与中平树SSR分子标记的筛选、开发以及全基因组深度测序提供了理论指导。     

杂交兰转录组SSR信息分析及EST-SSR标记开发应用

该研究主要开发筛选适用于杂交兰的EST-SSR引物,为杂交兰种质资源评价和遗传变异研究等提供可靠的分子标记。该研究对杂交兰进行转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并对不同种质的遗传多样性进行分析。结果表明,从31724条杂交兰Unigene中检测出18603个SSR位点,SSR出现频率为58.64%;SSR位点中的主导类型是单核苷酸重复,占总SSR的65.10%,其次是二核苷酸(23.56%)和三核苷酸(10.76%)重复;优势重复基元为A/T、AG/CT、AT/AT和AAG/CTT,分别占总位点的64.72%、13.74%、8.19%和2.51%。利用Primer Premier 5.0共设计了565对SSR引物,从筛选出的64对有效扩增引物中随机选择28对引物,对40份杂交兰种质进行多态性验证与遗传关系分析,其中16对(占57.14%)引物表现出可重复的高多态性,平均多态信息量(PIC)达0.789。基于扩增的多态性SSR信息,40份种质资源可聚为4类,聚类结果与其遗传背景基本一致。该研究印证了转录组测序获得的Unigene是SSR标记开发的有效来源,开发的EST-SSR引物可为杂交兰及近缘种的良种鉴别、遗传图谱构建、分子标记辅助育种及功能基因挖掘等提供有价值的候选标记。     

基于转录组数据的意大利蝗微卫星位点分析与分子标记开发

【目的】意大利蝗Calliptamus italicus (L.)是新疆荒漠半荒漠草原重要害虫。本研究利用已获得的意大利蝗转录组数据,鉴定其微卫星位点。【方法】使用MISA筛选SSR位点,利用Primer Premier 5设计引物,通过PCR扩增对引物进行验证。【结果】在意大利蝗转录组数据库中,共检测出156500个SSR位点,分布在126369条unigene中。其中,单核苷酸重复为60.88%,二核苷酸重复为23.58%,三核苷酸重复和四核苷酸重复分别为12.99%和2.04%。单核苷酸重复主要为A/T(44.38%),二核苷酸重复主要为AC/GT(12.99%)和AG/CT(8.05%)。基于筛选的SSR位点设计引物,随机挑选24对引物,对10个不同地理种群意大利蝗成虫DNA样品进行PCR扩增,共有6对引物扩增成功。【结论】本研究利用转录组数据发掘意大利蝗SSR位点,为意大利蝗分子标记、种群遗传及功能基因等研究奠定基础。     

亚麻EST-SSR信息分析与标记开发

与基因组SSR相比,以EST为基础的EST-SSR分子标记具有自身的优点。本研究从11240条亚麻（Linum sitatissmum L.）EST序列中检索出877条含有SSR的序列,其出现频率为7.8%。其中以三核苷酸重复出现的频率最高,占总SSR序列的60.1%;其次是二核苷酸重复,占21.9%;四、五和六核苷酸重复占18%。根据这些含SSR的EST序列共设计了73对SSR引物,在8份亚麻材料间通过PCR扩增检测,有63对引物扩增出清晰条带,引物可用率86.3%;有17对引物在8份亚麻材料间显现出多态性,占可扩增引物的26.3%。     

假眼小绿叶蝉微卫星位点的生物信息学分析

【目的】为开发假眼小绿叶蝉Empoasca vitis分子标记,采用高通量测序技术对假眼小绿叶蝉DNA进行了测序与分析。【方法】本研究基于Illumina Hi Seq测序技术,构建了PE文库(~400bp),对获得的测序数据利用生物信息学分析手段完成全基因组扫描,并进一步使用MISA分析鉴定基因组序列中出现的微卫星序列(SSR)。针对微卫星序列共设计10对引物,并使用3步法进行引物多态性筛选。【结果】共计检测Scaffold数量为183 194条,其中包含SSR的Scaffold共计1 545条,共计筛选出1 569个SSR位点。在假眼小绿叶蝉的微卫星中,共包括87种重复基元类型,二核苷酸与三核苷酸重复序列为主要重复类型,分别占SSRs总数的70.26%和27.84%;二核苷酸重复基元CA/TG和三核苷酸重复基元AAT/ATT是优势重复基元,分别占SSRs总数的33.96%和5.86%。在设计的10对引物中,5对具有多态性,在8个假眼小绿叶蝉个体中共发现16个等位基因。【结论】结果说明假眼小绿叶蝉SSR位点在多态性方面具有极大的可开发性,具有多态性的SSR位点可对假眼小绿叶蝉种群间的分化,种群间的扩散机理和途径及影响因素等问题提供分子视角。     

柑桔BES SSR标记开发及连锁图延伸和加密

为了系统性地开发和拓展柑桔SSR标记,通过对公布的柑桔BAC文库末端序列(BAC-End sequence,BES)进行SSR分析,选择1500个SSR位点设计合成并检测323对引物。结果表明:(1)从总长度为28.1 Mb的46 339条序列中共检测出22 403个SSR位点,约每2条序列就会出现一个SSR位点,发生频率为48%,相当于平均1.25kb的序列中就会出现1个SSR,频率约为柑桔EST的2倍,且不同核心重复序列的SSR发生特点与EST也不同。(2)所合成的323对引物中,有效扩增316对,扩增率约98%,173对表现多态性,总多态性比率约55%,多态性引物中单核苷酸重复类型15对,双核苷酸重复类型100对,三核苷酸及以上重复类型58对,表明柑桔BES中具有较为丰富的多态性SSR标记。(3)结合已发表的遗传作图数据,对总计349个多态性位点进行遗传连锁分析,获得的新遗传连锁图谱共含有9个连锁群、334个SSR标记、总长844.2cM、平均图距2.53cM,延长和加密了先前的图谱。该研究开发的新SSR标记为开展柑桔遗传鉴定分析和遗传图谱构建提供了新的标记来源,加密的遗传图谱为柑桔的基因定位、图位克隆和标记辅助育种等奠定了基础,SSR分析结果也为其他物种SSR标记的开发提供了参考。     

基于转录组测序信息的水生植物蕃菜SSR标记开发

利用软件MISA对水生植物蓄菜转录组测序所获得的79536条EST序列进行分析,共检测出12319个EST—SSR位点。在蓄菜的EST—SSR中,二核苷酸和三核苷酸重复单元是主导类型,分别占总SSR的57．31％和30．87％,其中AG／CT、AAG／C1_r分别是二、三重复单元类型的优势重复基元,分别占总SSR的29．76％和8．66％。随机挑选了130对EST-SSR引物对蓄菜两个居群进行遗传多样性检测,结果发现：78对引物能扩增出清晰可分辨的条带,其中37对能成功检测出多态性,引物多态率为47．44％。这些多态性引物共检测出114个等位基因,每个位点2—6个,平均3．08个。观测杂合度（心）及预期杂合度（He）分别在0．229～1．000和0．351-0．756之间,多态信息含量PIC值在0．286～O．698之间,平均达0．495。以上研究结果表明,通过萏菜转录组测序产生的EsT数据来开发SSR标记是一种简单而高效的途径,这些新的SSR分子标记为研究苔菜的居群遗传多样性及其遗传结构提供了工具。     

中间锦鸡儿转录组EST-SSR标记系统性识别与引物筛选

旨在对中间锦鸡儿转录组数据库EST信息进行SSR系统性识别和初步验证,为进一步SSR分子标记开发提供依据。对Hi Seq2000测序技术获得的中间锦鸡儿转录组Unigenes进行SSR位点搜索,共获得45 706个SSR位点,出现频率为10.38%,平均4.30kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以单核苷酸重复序列基元为主,所占比例为56.47%;二核苷酸、三核苷酸重复序列基元的数量所占比例分别是20.56%和21.04%;其他数量的基元所占比例仅为1.9%。多核苷酸重复类型中最多的为2核苷酸重复AG/CT;其次为3核苷酸重复AAG/CTT。针对EST-SSR位点随机挑选了150对引物,通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR验证,其中有79对能获得扩增条带,21对引物扩增出单一条带,比例为14.0%。     

沙冬青属植物叶绿体基因组对比和系统发育分析

该研究以沙冬青和矮沙冬青叶绿体基因组为研究对象,比较分析其基因组结构和系统发育关系。结果显示: (1)沙冬青和矮沙冬青的叶绿体基因组具有典型的四段式结构,全长为153 935 bp和154 140 bp,其中大单拷贝区(LSC)分别为83 891 bp和84 126 bp,小单拷贝区(SSC)分别为18 022 bp和18 014 bp,以及长度各自为26 011 bp和26 000 bp的成对反向重复区(IRs);沙冬青和矮沙冬青均注释130个基因,包括85个蛋白编码基因(PCGs),37个转运RNA(tRNA)以及8个核糖体RNA(rRNA)。(2)沙冬青和矮沙冬青的叶绿体基因组中分别检测出26和15个回文重复序列,39和50个串联重复序列,23和34个散在重复序列。同时都鉴定出96个SSRs位点,包括74和73个单核苷酸重复,5和6个二核苷酸重复,以及各有17个复合SSR位点;边界分析显示两者IR区相似,但仍有一定差异。(3)通过近邻结合法(NJ)对沙冬青和矮沙冬青在内的17种蝶形花亚科以及2种云实亚科植物的叶绿体基因组构建的系统发育树显示,沙冬青和矮沙冬青以较高的支持率聚为一个独立分枝。该研究结果为沙冬青属的种间鉴别、SSR分子标记开发、保育工作、种群动态以及进一步研究坡塔里族的演化过程奠定了理论基础。