日本菟丝子的生防研究——寄生真菌的筛选和利用

对日本菟丝子有较强致病力的刺盘孢菌,其在PDA培养基上的特点是,菌落桔红色,产孢量大,气生菌丝稀疏,不形成分生孢子盘和刚毛。 不太可能筛选出一个对所有寄主上的日本菟丝子都有较强致病力的菌株,但完全有可能筛选出对其中少数几个主要寄主上的菟丝子均有较强致病力的菌株。 高温高湿和伤口对菌株的侵染有利;菌株的孢子悬浮液中加入2％蔗糖或少量菟丝子压榨液可促使孢子提早萌发并提高其萌发率。 菟丝子的茎蔓尤其幼嫩部分比花穗更易感病。 固体扩大培养基的成分中,用80％麦麸加20％玉米粉配制较好,菌株的产孢量大。     

日本菟丝子的生物防治研究初报危害性及寄生真菌的筛选

危害林木的菟丝子在广西主要是日本菟丝子(Cuscuta aponica Choisy),其危不仅表现在它寄生的普遍性和严重性。还表现在它寄生的持久性。其中以龙眼、柚子、桂花、台湾相思等被害严重。 在菟丝子寄生真菌的筛选中发现(1)对日本菟丝子有较强致病力的菌株是刺盘孢菌(Colletotrichum spp)。(2)这些菌株中的绝大多数对同种寄主上含不同色素的同种菟丝子有不同的致病力,仅有少数表现相近似的,但它们的致病力相对较弱。(3)对大多数菌株来说,同一菌株对来源于不同寄主上的同种色泽的同种菟丝子有不同的致病力。     

六株虫生真菌的生物学特性及其对油茶象甲的致病力

为了筛选防治油茶象甲的虫生真菌菌株,本研究测定了不同绿僵菌(Ma09、Ma25、Ma05、Mac985)和白僵菌(Bb01、Bb02)菌株的生长速度、产孢量以及孢子萌发率,采用孢悬液浸渍法测定了上述菌株对油茶象甲成虫和幼虫的致病力。结果表明,Ma09、Ma05、Bb01、Bb02菌株的菌落直径分别为63.13、62.55、61.99、61.90 mm(25℃、15 d),生长速度显著快于其余菌株(P0.05);Ma25、Bb01、Ma09菌株的产孢量分别为3.04×10~8、2.88×10~8、2.85×10~8孢子/cm~2,显著高于其余菌株(P0.05);Bb01和Ma09菌株的孢子萌发率较高,分别达到97.80%和96.40%。不同菌株对油茶象甲成虫和幼虫致病力差异显著,其中Bb01和Ma09在1×10~7孢子/mL时,对油茶象甲成虫的LT_(50)分别为4.64 d和4.93 d,处理后15 d累计校正死亡率均达到100.00%,僵虫率分别为76.00%和78.67%;对幼虫的LT_(50)分别为2.15 d和3.48 d,10 d累计校正死亡率均达到100.00%,僵虫率分别为81.00%和86.31%。本研究筛选的Bb01和Ma09菌株具有生长快、产孢量大、孢子萌发率高、对油茶象甲致病力强等特性,在油茶象甲的生物防治中具有潜在的应用价值。     

日本菟丝子寄生菌致病力的专化性研究

日本菟丝子(Cuscuta japonica)吸取不同寄主植物的营养,经过营养代谢其机体内的过氧化物酶同工酶的活性或酶带数发生变化,从而改变了它对胶孢炭疽菌菟丝子专化型[Col-letotrichum gloeosporioides(Penz.)Sacc.f.sp.Cuscutael]同一菌株的抗性,以此为依据,采用寄生在不同植物上的日本菟丝子做为鉴定寄主,可以鉴别出胶孢炭疽菌菟丝子专化型中不同菌株的致病力差异。 初步认为:龙眼、桂花、柚子和冬青上的紫色菟丝子及泡桐、桂花和冬青上的黄色菟丝子可以作为鉴定寄主。     

石楠锈孢锈菌重寄生菌的鉴定及产毒培养基筛选

将3株重寄生拟盘多毛孢PG52、PG53和PG90鉴定到种,筛选出三者最佳产毒培养基,旨为毒素的分离鉴定奠定基础。通过PAUP软件构建系统发育树,并结合形态特征将3株拟盘多毛孢鉴定到种;以不同培养基制备的粗提物处理石楠锈孢锈菌和茶藨生柱锈菌的锈孢子,利用台盼蓝染色法和生测法筛选最佳产毒培养基。分子鉴定结果显示PG52与PG90属于同一个分支,与Pestalotiopsis kenyana和Pestalotiopsis Oryza在同一个大分支,PG53与Pestalotiopsis telopeae在同一个分支;从形态特征来看,PG53的形态与Pestalotiopsis telopea的形态描述基本一致;PG52和PG90的形态特征与Pestalotiopsis kenyana的形态描述一致;PG52于改良Fries培养基制备的粗提物处理孢子效果最好,PG53于改良M-1-D培养基制备的粗提物处理孢子效果最好,PG90于改良M-1-D培养基制备的粗提物处理孢子效果最好。PG52和PG90同属一种拟盘多毛孢菌为Pestalotiopsis kenyana;PG53为Pestalotiopsis telopeae的菌株。PG52菌株的最佳产毒培养基为改良Fries培养基;PG53菌株的最佳产毒培养基为改良M-1-D培养基;PG90菌株的最佳产毒培养基为改良M-1-D培养基。     

农杆菌介导的小孢拟盘多毛孢遗传转化及突变体筛选

本研究通过农杆菌EHA105介导的方法,以含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体pCAMBgfp为转化载体,对小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora KFRD-2菌株进行遗传转化。基于潮霉素及GFP荧光抗性进行转化子的初步筛选,随后,进一步对转化子的菌落特征、菌丝生长速率、产孢量、荧光稳定性及致病力进行验证。结果获得阳性转化子100余株,转化效率达200个转化子/10⁶个孢子。大部分转化子与野生型菌株无明显形态及致病力差异。同时,获得了14株菌丝形态、产孢量或致病力与野生型存在明显差异的突变株,可用于小孢拟盘多毛孢关键致病基因的挖掘验证及致病机理等研究。     

哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究

哈茨木霉是一类重要的植病生防因子。哈茨木霉TH-1分别在PDA培养基、麦芽糖培养基、查氏培养基和琼脂培养基上培养均能产孢,其中PDA培养基为最适培养基。PDA培养基上,菌丝生长适宜温度27．5℃～35℃,最适温度32．5℃,产孢最适温度27．5℃。菌丝生长适宜pH值为3～7,产孢适宜pH值为5-9,生长与产孢最适pH值为5。光照对菌丝生长影响不大但明显影响菌株的产孢数量,光照时间越长产孢量越大。对峙培养试验表明TH-1明显抑制疫霉菌的生长速率,其无菌滤液明显抑制烟草疫霉菌游动孢子的萌发,并抑制游动孢子芽管的伸长,TH-1对游动孢子萌发的相对抑制率为12．7％,对芽管生长长度的相对抑制率为63．1％。水解酶平板活性测定显示,TH-1产生β-1,3葡聚糖酶与纤维素酶,从而使烟草疫霉菌细胞壁的消解,产生非挥发性抗生素抑制烟草疫霉菌孢子萌发,但对菌丝生长影响不大。     

哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究*

哈茨木霉是一类重要的植病生防因子。哈茨木霉TH-1分别在PDA培养基、麦芽糖培养基、查氏培养基和琼脂培养基上培养均能产孢,其中PDA培养基为最适培养基。PDA培养基上,菌丝生长适宜温度27.5℃~35℃,最适温度32.5℃,产孢最适温度27.5℃。菌丝生长适宜pH值为3~7,产孢适宜pH值为5~9,生长与产孢最适pH值为5。光照对菌丝生长影响不大但明显影响菌株的产孢数量,光照时间越长产孢量越大。对峙培养试验表明TH-1明显抑制疫霉菌的生长速率,其无菌滤液明显抑制烟草疫霉菌游动孢子的萌发,并抑制游动孢子芽管     

不同寄主来源的灰葡萄孢对番茄的致病力分化研究

从安徽合肥、蚌埠、长丰、和县等市、县的番茄、辣椒、草莓、葡萄等发病寄主上分离鉴定获得18个灰葡萄孢Botrytis cinerea菌株,采用菌丝块创伤接种法,分别测定了上述不同寄主来源的灰葡萄孢菌对番茄果实和叶片的致病力.结果表明,所有供试菌株接种番茄果实后均引起发病,但不同菌株所致病斑的平均直径有显著差异,显示灰葡萄孢菌株间对番茄果实的致病力存在明显分化.按照在番茄果实上所致病斑的平均直径大小可将供试菌株致病力划分为较强、中等和较弱3种类型.总体来说,来自番茄的菌株对番茄果实的致病力较强,来自草莓、葡萄和辣椒的菌株对番茄果实的致病力较弱,但来自相同寄主的菌株间致病力也存在差异,菌株致病力差异与菌株地域来源无明显相关.供试灰葡萄孢菌株接种番茄叶片后,除CF1外,均可引起番茄叶片发病,但不同菌株所致番茄叶片病斑的平均直径也有显著差异;供试菌株对番茄叶片的致病力差异与菌株的寄主和地域来源无显著相关.     

啤酒酵母产子囊抱子及获得单倍体细胞条件的研究

啤酒酵母在不同产孢培养基上表现出不同的产孢率,随菌株不同各有其最适的产孢培养基。试验表明,4号培养基对供试菌株均表现出较高的产孢率,其次是1号培养基,用2％蜗牛酶于37℃水浴酶解3小时即可除去子囊壁;将酶解液置于58℃水浴保持8分钟,可杀死营养体细胞;用1％胰蛋白酶或超声波(150W,3分钟)处理,可使50％以上的孢子分散开。     

鲁保一号菌的菌种退化

我们在研究用鲁保一号(Gleosporium sp.)防治菟丝子时,发现这种真菌很不稳定。从严重发病的菟丝子上分离到的菌株,经多代培养后,菌落由桔红转为黄绿,逐渐产生气生菌丝,孢子不整齐,发芽率低,产孢量下降,致病力降低,甚至完全丧失生产使用价值。经试验发现并证明,这种真菌经培养多代后,由于一些核产生突变。就形成了由亲代类型(Ⅰ型)和突变类型(Ⅱ型)两种类型核组成的菌株。在传代过程中,同一菌株中这两种核的比例很不稳定,致病力低的突变类型核有逐渐上升的趋势,这是鲁保一号菌种退化的主要原因。实验结果如下。     

球孢白僵菌不同分离株的生物学及对小猿叶甲成虫致病性测定

球孢白僵菌Beauveriabassiana是一种寄主范围广、致病性强、适应性广的昆虫病原真菌。对采自广东阳山小猿叶甲Phaedonbrassicae的球孢白僵菌 6个分离株 (A ,B ,C ,D ,E ,F)的菌落生长速率、产孢量、分生孢子萌发率进行了实验 ,测定和比较了这 6个分离株对小猿叶甲成虫的致病力。结果表明 :各分离株在菌落生长速率上没有显著差异 ,但各分离株的孢子萌发率有显著差异 ,其中C ,D ,E分离株产孢量明显高A ,F分离株。用 5× 1 0 7分生孢子 mL的悬浮液处理小猿叶甲成虫 ,分离株间的致病力有显著的差异 ,以D分离株对小猿叶甲成虫的感染死亡率最高 ,为 86 67%。综合比较 ,产孢量和致病性较高的D分离株可作为进一步研究的材料。     

海南椰心叶甲病原菌金龟子绿僵菌的分离、鉴定及其生防潜力

椰心叶甲[Brontispa longissima（Gestro）]是椰子的重要害虫,近年来,该虫在海南岛发生普遍,椰子受害严重。由于椰心叶甲受到自然界中某些致病微生物的侵袭,在受害的椰子树心叶上常可发现椰心叶甲僵虫,并发现大部分僵虫表面长出了霉菌,本研究的目的在于从椰心叶甲僵虫表面的霉菌中分离出绿僵菌,并对分离菌株进行鉴定和致病性测定。从僵虫表面刮下孢子或菌丝体,置于绿僵菌选择性培养基（DOA）上培养,挑出真菌菌落,经纯化后,进行生物学特性、菌落生长速率及产孢量的测定,并从PPDA、OMA、VSA和PDA中筛选菌落生长及产孢最适培养基,同时对所分离的菌株进行对椰心叶甲的致病性测定。结果表明,所有分离菌株均鉴定为金龟子绿僵菌[Metarhizium anisopliae（Metschnikoff）],PPDA是菌落生长及产孢的最适培养基,大多数菌株对椰心叶甲有较强的致病力。选取强毒菌株MA4在田间进行防治效果的初步测定,结果表明,该菌株能显著降低椰心叶甲成虫的虫口密度。这些金龟子绿僵菌菌株是首次从海南的椰心叶甲僵虫中分离到的昆虫病原真菌,该菌对海南的椰心叶甲具有很好的生防潜能。     

温湿度对玫烟色棒束孢IF‐1106菌株孢子萌发及对烟粉虱致病力的影响(英文)

B型烟粉虱Bemisia tabaci Gennadius是一种重要的世界性农业害虫。玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea是防治烟粉虱的一种重要的虫生真菌。对不同温度(20、23、26、29、32℃)、不同湿度(53%、65%、75%、85%、95%)下玫烟色棒束孢IF‐1106菌株分生孢子萌发及其对烟粉虱的致病力进行了测定。结果表明:温度对孢子的萌发有显著影响,26℃时孢子萌发率最高。当相对湿度低于75%时,孢子不萌发或萌发率较低;当相对湿度为85%–95%时,孢子萌发率显著升高。26℃时,烟粉虱2龄若虫的累计死亡率最高。随着相对湿度增大,病菌的致病力增强。当相对湿度为53%–95%时,烟粉虱2龄若虫累计死亡率从54.55%增加到88.89%。玫烟色棒束孢的致病力与孢子萌发率呈正相关,但温度比相对湿度对其影响更明显。结果表明,玫烟色棒束孢IF‐1106菌株侵染烟粉虱的最佳条件是温度26℃和相对湿度大于85%。     

球孢白僵菌不同碳氮源的研究及对烟粉虱的时间-剂量-死亡率模型分析

【目的】明确不同碳、氮源对球孢白僵菌Beauveria bassiana生长的影响,确定适合该菌株生长的碳、氮源;通过研究球孢白僵菌对烟粉虱Bemisia tabaci的致病力,评价球孢白僵菌防治烟粉虱的潜力。【方法】在培养基中添加不同碳、氮源,研究其对球孢白僵菌生长速率和产孢量的影响,用浸叶法研究不同孢子浓度(1×10~4、1×10~5、1×10~6、1×10~7、1×10~8个/mL)的球孢白僵菌对烟粉虱的致病力并利用时间-剂量-死亡率模型对数据进行拟合,分析该模型的时间效应和剂量效应。【结果】蔗糖作为碳源、酵母作为氮源时球孢白僵菌的生长速率快和产孢量高;利用时间-剂量-死亡率模型对测定的数据进行拟合分析得出,随着接种天数的增加,球孢白僵菌的LC_(50)、LC_(90)逐渐降低,剂量效应增强;随着孢子浓度的增加,LT50逐渐降低,时间效应增强。【结论】球孢白僵菌的合适碳源为蔗糖,最适氮源为酵母。该菌株对烟粉虱有较强致病力,1×10~8个/mL的孢子浓度可作为防治烟粉虱的理想浓度,本试验为球孢白僵菌对烟粉虱的生物防治提供有力依据。     

链格孢菌毒素合成相关基因研究进展

链格孢属真菌(Alternaria Nees)是世界上分布最广泛的真菌之一,可产生9种寄主选择性毒素(host-selective toxins,HST)。根据寄主不同,将链格孢属的7个生理小种称为链格孢菌(Alternaria alternata)的7种致病型。每种致病型产生的HST都是低分子质量的次级代谢产物,只对敏感品种有毒,对抗性品种无毒。参与HST生物合成的基因都是多拷贝的,这些共同表达的基因组成基因簇。各致病型的基因簇位于一条小于2.0Mb的conditionally dispensable(CD)染色体上,CD染色体的不稳定性不影响菌丝的生长和孢子的萌发,但与菌株的致病力有关。从链格孢菌6种致病型得到毒素合成基因,日本梨致病型、草莓致病型、橘致病型有共同的EDA结构域,这3种致病型有很多EDA生物合成需要的同源基因。HST的分子遗传学研究为链格孢菌不同致病型的演化提供了新的见解。     

尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究

由尖镰孢古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产中的毁灭性病害之一。Foc有4个小种,其中4号小种(Focr4)因其寄主范围广且无高抗病性的香蕉品种,对香蕉产业的危害最大,其致病机制至今尚不清楚。为研究其致病机制,本文对Focr4野生型菌株(Focr4-193-6)、因其T-DNA插入导致致病性严重减弱的突变体Focr4-1701、T-DNA插入标签基因敲除子△Focr4-1701及敲除基因互补子△Focr4-1701-cp-1为材料,从致病性测定、玻璃纸穿透试验、孢子形态观察、产孢量与孢子萌发率测定、粗毒素测定等方面对其与致病性相关的生物学表型进行了测定。结果表明:T-DNA插入突变体Focr4-1701和基因敲除突变体△Focr4-1701接种后的香蕉植株叶片没有表现发病症状,敲除基因互补菌株与野生型菌株一样表现出发病症状;T-DNA插入突变体和基因敲除突变体不能穿透玻璃纸生长,T-DNA插入突变体及基因敲除突变体在产孢量、孢子萌发率和产毒素能力上均极显著低于野生型菌株及互补菌株。这些表型性状差异说明Focr4-1701致病性严重减弱可能是T-DNA插入位点标签基因失活后导致了菌丝体侵染能力下降及产毒素能力降低造成的。     

美国白蛾高毒力球孢白僵菌菌株筛选

【目的】美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)是世界性检疫害虫,目前已经入侵到我国长江下游地区(从辽宁丹东至安徽芜湖)。作者在前期研究中,在芜湖地区成功获得了被球孢白僵菌Beauveria bassiana侵染的美国白蛾僵虫。本研究拟在前期已获取菌株的基础上,筛选生物学性状良好且对美国白蛾幼虫具有高致病力的球孢白僵菌菌株,以期为我国长江下游地区利用昆虫病原真菌防治美国白蛾奠定基础。【方法】对采集自美国白蛾僵虫的7株球孢白僵菌菌株(Bb01-1,Bb08-5,Bb08-6,Bb08-11,Bb22-2,Bb22-3和Bb22-5)进行生物学特性研究,以候选菌株菌落形态、生长速率、产孢量、萌发率和抗紫外能力等参数确定优良菌株;并将生物学性状良好的球孢白僵菌菌株配制成5个浓度(5×10~6,1×10~7,5×10~7,1×10~8和5×10~8孢子/m L)的孢悬液,采用浸渍法处理美国白蛾4龄幼虫,以幼虫死亡率、侵染率等指标评价菌株的致病力。【结果】供试菌株Bb22-2,Bb22-3和Bb22-5为粉状菌落,其菌落直径大,产孢早且孢子层厚;同时,这3个菌株在菌落生长速率和产孢量以及孢子萌发率、紫外照射处理后的萌发率也均显著优于其他4个菌株。毒力测定结果表明,这3个菌株对美国白蛾4龄幼虫表现出很强的致病力,各菌株处理11 d后美国白蛾幼虫校正死亡率为80%~90%。这3个菌株对美国白蛾幼虫的侵染率均高(侵染率53%~87%),并且呈现随浓度升高侵染率上升的趋势。其中,菌株Bb22-2侵染率均要高于其他2个菌株。【结论】本研究成功筛选获得了生物学性状良好且对美国白蛾高毒力的球孢白僵菌菌株。鉴于中国长江下游地区气候特点与美国白蛾生物学习性,可以预期采用昆虫病原真菌防治美国白蛾在该地区将具有很好的应用前景,但其实际应用价值尚需进一步的田间试验进行确认。     

橡胶树胶孢炭疽菌NADPH氧化酶功能研究

由病原真菌胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶减产的主要原因之一。研究橡胶树胶孢炭疽菌致病力的分子机制能为其病害防治提供理论依据。采用同源重组原理、运用原生质体转化法构建了橡胶树胶孢炭疽菌NADPH氧化酶编码基因的敲除突变株,并对其生长发育及致病力等生理表型进行分析。结果表明,在橡胶树胶孢炭疽菌中,存在3个编码NADPH氧化酶的基因CgNoxA、CgNoxB、CgNoxC,以及一个编码NADPH氧化酶调节蛋白的基因CgNoxR。PCR分析表明成功构建了这4个基因的敲除突变株。与野生型菌株相比,这4个敲除突变株的产孢能力、致病力均有不同程度的变化。其中CgNoxA敲除突变株的产孢能力严重受损;CgNoxR敲除突变株的孢子萌发过程明显异常;CgNoxB敲除突变株对橡胶树叶片的致病力显著下降。染色观察表明,CgNoxA和CgNoxB参与调控胶孢炭疽菌菌丝中超氧阴离子代谢过程。上述结果表明,NADPH氧化酶在调控胶孢炭疽菌的孢子萌发及致病力过程中起着重要作用。     

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)培养特征多样性与寄主及地理来源的相关性分析

球孢白僵菌不同菌株微观萌发特征及宏观培养特性表现出高度的多样性,2个性状集团经主成分分析后,得到微观萌发特征的主因子为单芽管萌发孢子比例、芽管总平均长度及芽管整齐度;宏观培养性状的主因子分别为察氏培养基上的菌落颜色、菌落基质颜色、菌落生长速率及液体培养液的pH值。由主因子指标进行典型相关分析,两性状集团总体相关不显著(p=0.1378),但菌落生长速率与单芽管萌发孢子比例及芽管总平均长度表现出显著的相关性。由主因子指标进行的聚类及Shannon-Wiener多样性指数统计表明,相同地理来源菌株间的相似性程度高于相同分离寄主间的菌株相似性。