鱼类细胞克隆培养的研究

在哺乳类细胞中,细胞克隆培养已获得了广泛的应用,而在鱼类细胞中,尚未见到有关克隆化培养的报道。建立适合鱼类细胞的克隆培养技术,对于鱼类的细胞生物学、生物化学、病毒学、体细胞遗传学和细胞工程的研究,具有广泛的实用价值。我们成功地进行了鱼类细胞克隆的培养。现将主要试验结果作一简要报道。       

鲤鱼(Cyprinus carpio)体细胞系的建立及其生物学特性分析(简报)

动物细胞的培养技术是1907年哈里逊在淋巴块中对蛙的神经板培养成功开始的,其后近一个世纪以来,陆续成功地培养了哺乳动物、昆虫等各种动物细胞,并广泛用于生物科学的各个分支。鱼类的细胞培养的系统研究和建系实践大约起始于60年代,被公认的真骨鱼类的第一个永久性的细胞系——虹鳟性腺细胞系(RTG-2)是由Wolf建立的。随后各种鱼类细胞系相继建立,涉及的组织来源有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、性腺、肝脏、胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等,同时也进行了细胞体外培养条件、保存条件以及生物学特性的研究,为渔业生产和科学研究做出了重要贡献。研究者可利用来自不同种的培养细胞进行细胞杂交(融合)、核移植、DNA介导的基因转移以及一些物理图谱的建立等。细胞系在细胞生物学、遗传学的研究及培育动植物新品种等方面起着重要作用。本文首先对鲤鱼的尾鳍和吻端上皮细胞进行培养,建成鲤鱼体细胞系并对其生物学特性进行了分析。在此试验中我们侧重寻找适合做克隆供体的细胞达到最佳状态的条件, 以优化供体细胞的质量(另文报道)。此研究正在进行中。     

红豆杉单细胞克隆的建立

本文报道了红豆杉单细胞克隆的建立过程,在红豆极细胞克隆中使用悬浮培养１０－１５天的细胞培养物分离单细胞进行看护培养的效果最好。     

对小鼠ES细胞进行特异性的标记

虽然ES细胞技术的应用十分广泛,对ES细胞多能性本质的研究还不是很深入,体外培养的ES细胞群体的不均一性加大了这方面研究的难度,报道了对ES细胞中特异表达的基因,将报告基因βgeo插入oct-基因转录元件中构建了标记载体pG18NG,转染ES细胞MESPU22和MESPU13后获得了稳定整合的细胞克隆,经体外培养、诱导分化、嵌入体制作等实验,证明利用该载体对ES细胞中的未分化细胞成功进行了标记,该标记在体内、体外都是有效的。     

条纹斑竹鲨IRF-1基因的克隆和特征分析

鱼类中IRF-1基因的克隆测序目前仅局限于辐鳍鱼类1,2,而在软骨鱼类中未见报道。IRF-1是干扰素调节因子家族的成员之一3。除作为干扰素的转录调节因子外4,还具有其他功能5-10。作为天然免疫重要的调节因子其基因在哺乳类中得到了广泛的克隆和分析。IRF-1与其他家族成员一样,在氨基末端前115个氨基酸都具较高同源性,具有色氨酸重复特征且包围在DNA绑定域周围。       

抗新霉素基因对草鱼肾细胞的磷酸钙共沉淀转移

自1973年 Graham 和 Van der Eb 首次成功地应用 DNA-磷酸钙共沉淀法转化哺乳动物培养细胞以来,又提出了电脉冲法;显微注射法;磷脂载体法及细菌原生质体融合法等多种培养细胞基因转移方法。然而,目前的研究多局限于哺乳动物细胞,鱼类培养细胞方面的报道却很少。建立鱼类培养细胞基因转移的方     

鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建

紫外线灭活的草鱼出血病病毒（GCHV）能诱导鲫囊胚培养细胞（CAB）产生高滴度的干扰素,从而诱导宿主细胞基因表达的改变并处于抗病毒状态。提取灭活病毒诱导未经病毒诱导的CAB细胞mRNA,利用抑制性差减杂交技术,成功构建了鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库。以鲫管家基因α－tubulin和β－actin作为差减指标,检测差减cDNA文库的差减效率分别高达2^15和2^7倍,表明经过病毒诱导后的细胞中,某些差异表达基因的富集效率也接近2^15倍。鱼类抗病毒基因差减cDNA文库的建立对快速分离、克隆鱼类抗病毒相关基因和认识鱼类细胞抗病毒免疫的分子机理有重要意义。     

草鱼椎骨间质细胞的培养

鱼类细胞培养不仅在病毒学及细胞生物学的研究中起重要作用,也是生物进化、发育及遗传研究的极好材料1,2.有报道指出高等脊椎动物的骨髓间质细胞具有分化成多种细胞的功能3.常用于细胞培养的鱼类组织有心、鳍、卵巢、肾及肿瘤等4,5,鱼类没有骨髓6,因此草鱼(ctenopharyngodon idellus)骨间质细胞的培养,对探讨鱼类免疫细胞分化途径、鱼类造血组织的发育及分化潜能具有重要意义。       

鱼类细胞核移植的历史回顾与讨论

介绍60年代以来主要是中国在鱼类克隆研究中所获得的实验进展和成果,包括迄今只能在鱼类中得到的,具有发育“全能性”的核质杂种克隆鱼,和早在80年代初中国就已报道过用体细胞核移植所获得的“克隆鱼”,其记录要比“多莉羊”的报道早15年之久。本文还对过去36年中所获得的有关实验结果进行了分析和讨论并试图联系其它“克隆动物“对其发展前景作些探讨。     

鱼类干扰素系统基因研究进展

干扰素是一类多基因家族诱导性细胞因子,可在脊椎动物细胞中诱导建立抗病毒状态,并在抗病毒防御中起重要作用。干扰素系统包括应答外界刺激(如病毒感染)而合成干扰素的细胞,和应答干扰素建立抗病毒状态的细胞。干扰素系统基因主要包括Ⅰ型干扰素、Ⅱ型干扰素、干扰素刺激基因以及组成干扰素信号传导系统的基因。鱼类干扰素类作用发现较早,而对其基因的克隆和鉴定较晚。随着哺乳类和鸟类中干扰素及其相关基因研究的开展和深入,近年来鱼类干扰素及其相关基因的研究也得到快速发展。综述了鱼类干扰素系统基因的克隆、鉴定,以及其功能方面的研究进展。     

人外周血中LAK细胞的克隆化

本文报道首次采用半固体-液体两步法克隆正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)获得成功。先用含重组人白细胞介素2(rhIL-2)的软琼脂半固体克隆外周血中的T细胞,再将T细胞克隆转移至96孔板中继续在含rhIL-2的液体中培养。~(51)Cr释放的结果表明,约10～30％的克隆对NK敏感的K562细胞和NK不敏感的H7402、Anip-1肿瘤细胞均有细胞毒性,即为LAK细胞克隆。LAK细胞克隆能在体外含rhIL-2培养液中增殖1.5～3.0个月,每个克隆可扩增至10~9～10~(10)个细胞,仍然维持LAK细胞活性。表型分析的结果表明,克隆的LAK细胞CD3( )、CD8( ),属T细胞系统。有增殖能力的LAK前体细胞在PBMNC中的频率约为1～3×10~(-4)。用有限稀释法将LAK细胞克隆进一步亚克隆,98％以上的亚克隆均有LAK活性,表型也和原克隆相同,证实原克隆具有克隆源性。本文的两步法克隆LAK细胞程序可在较短时间内获得大量均一的LAK细胞,极大地有助于LAK细胞的深入研究和广泛应用。     

条石鲷雌雄鱼核型及C-带的比较分析

染色体核型和带型分析是鱼类细胞遗传学研究的重要内容之一,不仅对认识鱼类的分类系统、进化关系及染色体演化过程具有重要意义,还可为鱼类遗传育种提供细胞遗传学依据。我国从20世纪70年代开始开展鱼类细胞遗传学方面的研究,到目前为止,有关鱼类染色体核型已有很多报道。在海水鱼类中,据不完全统计,至2006     

鱼类细胞电融合的初步研究

电融合是一种细胞生物学新技术,它的融合率高、操作简便、无毒性、可在显微镜下直接观察融合过程,是细胞杂交与基因转移的有效手段之一。近几年来,这一技术已广泛用于动物、植物、微生物细胞和原生质体的融合1～4。但是,至今未见有电场诱导鱼类细胞融合的研究报道。我们采用国产元、器件,研制出一套供试验用的电融合装置,研究了电场诱导鱼类细胞的融合效应。       

黄鳝β-actin基因的克隆及其在鱼类中的系统发生分析

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构,细胞内运动,细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的黄鳝β-actin基因的cDNA全长1860bp,编码375个氨基酸,在脊椎动物中不同物种的β-actin基因之间的序列同源性超过了98％。RT-PCR表明克隆的黄鳝β-actin基因在睾丸、卵巢、心、肝、脾、脑等组织中广谱表达。基于目前已知的全部鱼类β-actin cds,构建了进化树。星形辐射的树型结构一致支持将鱼类β-actin基因划分为4类。到目前为止,所有的鱼都没有发现拥有全部4个β-actin基因。这暗示伴随着鱼类的辐射式进化历程,可能发生了种系特异性的β-actin的丢失。     

鲤鱼（Cyprinus carpio）体细胞系的建立及其生物学特性分析（简报）

动物细胞的培养技术是1907年哈里逊在淋巴块中对蛙的神经板培养成功开始的,其后近一个世纪以来,陆续成功地培养了哺乳动物、昆虫等各种动物细胞,并广泛用于生物科学的各个分支。鱼类的细胞培养的系统研究和建系实践大约起始于60年代,被公认的真骨鱼类的第一个永久性的细胞系——虹鳟性腺细胞系(RTG-2)是由Wolf建立的。随后各种鱼类细胞系相继建立,涉及的组织来源有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、性腺、肝脏、胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等,同时也进行了细胞体外培养条件、     

鲤鱼金属硫蛋白基因启动区功能的研究

以氯霉素乙酰化酶作为报讯基因、利用草鱼肾培养细胞瞬时表达系统,对已克隆的鲤鱼金属硫蛋白基因５’－调节区１．６ｋｂ的序列进行了功能分析。从顺式效应和反式效应研究证明：所克隆的鲤鱼ＭＴ基因５‘－调节区具有典型ＭＴ启动子的特性实验发现哺乳动物病毒ＳＶ４０增强子要以加强鱼类ＭＴ启动子的活性,提示在系统进化上鱼类基因不但存在增强子元件,并具有哺乳动物增强子相似的作用方式,而且作用于增强子的反式效应因子也存在     

鱼类染色体G—显带的Brd U—BSG方法及白鲢G—带模式图的初步建立

本文报道了一种显示鱼类染色体G-带的BrdU-BsG方法。采用肾细胞短期培养,收获前12小时加入BrdU,使终浓度为10μg/ml。制片经HCl、Ba(OH)_2处理,4×SSC温育。Giemsa染色,显示出白鲢的G-带。其带纹细致清晰,一个细胞的单倍染色体上显示带纹达200条以上,是目前已报道的鱼类多重带中带纹最多的,且反差明显,带纹有特征性,结果较稳定。根据实验结果初步建立了白鲢的G-带模式图。     

人诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)系的建立

掌握建立人iPS细胞系(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的技术,以便为人肿瘤细胞重编程为iPS细胞建立技术平台.在人胚胎干细胞的培养条件下,通过携带Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个混合因子的慢病毒感染人皮肤成纤维细胞(CCD-1079SK细胞),从而诱导成干细胞样的克隆.根据人胚胎干细胞的特性进行如下鉴定:克隆形态、碱性磷酸酶活性、核型和CCD-1079SK细胞来源的克隆拟胚体(embryoid bodies,EBs)形成及分化等.结果显示,在人胚胎干细胞的培养环境中,导入Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个因子的CCD-1079SK细胞产生了一株iPSC克隆,这株iPSC克隆在细胞形态、增殖能力、胚胎细胞特异性表面抗原以及基因表达与人胚胎干细胞相似,此外,iPSC克隆在体外悬浮培养中形成拟胚体并分化成3个胚层.人iPS细胞系的成功建立为利用iPS细胞技术开展肿瘤细胞重编程研究奠定了坚实基础.     

鱼类细胞的培养及其染色体标本的制备

自桑福德(Sanford)等从哺乳类动物的长期培养细胞成功地获得细胞克隆(Clone)以来,随着技术的提高与合成培养基的确立,组织培养法在体细胞遗传学、发育生物学、免疫学、肿瘤学及细胞工程学等研究领域中都得到了越来越广泛的应用。当前,在包括人类在内的哺乳类动物细胞遗传学的研究中,尤其在染色体组型的分析中,组织培养法正在发挥它的重要作用。     

生产用重组哺乳动物细胞株的克隆筛选方法

克隆筛选是重组细胞株构建过程中的关键步骤。除了早期的克隆环,有限稀释法、半固体培养法、流式细胞术和细胞分选是目前生物制药行业运用最为广泛的克隆筛选方法。该文综述了克隆筛选方法的原理、特点,介绍了促进方法发展的其他技术如单细胞成像和自动化,比较了不同克隆筛选方法的优缺点。针对如何选择合适的克隆筛选方法提出了建议,为从事相关研究与生产领域的科研人员提供帮助。