腺苷对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用

本研究旨在探讨腺苷 (adenosine ,ADO)对缺氧 /复氧 (hypoxia/reoxygenation ,H/R)心肌细胞的保护作用及其分子机制。将原代培养的新生大鼠心肌细胞分成H/R对照组和ADO (1 0 μmol/L)保护组。用倒置相差显微镜观察心肌细胞的生长状态。检测两组培养基质乳酸脱氢酶 (LDH)活性和心肌细胞Ca2 + 和丙二醛 (MDA)浓度。用ELISA法检测肿瘤坏死因子 (TNF α)的表达 ,并用凝胶电泳迁移率改变法 (EMSA)测定核因子 (NF κB)结合活性。所得结果如下 :(1)心肌细胞H/R培养后皱缩、变圆 ,伪足减少 ,ADO组心肌细胞的形态变化小于对照组 ;(2 )ADO减少缺氧和复氧期间心肌细胞LDH的漏出 (bothP <0 0 1) ;(3 )ADO降低缺氧和复氧期间心肌细胞内的Ca2 +浓度 (bothP <0 0 1) ;(4)ADO降低缺氧和复氧期间心肌细胞MDA浓度 (bothP <0 0 1) ;(5 )ADO抑制缺氧和复氧期间TNF α的表达 (bothP <0 0 1) ;(6)ADO抑制缺氧和复氧期间心肌细胞NF κB结合活性 (bothP <0 0 1)。以上结果提示 :(1)外源性ADO可减轻心肌细胞的H/R损伤 ;(2 )外源性ADO抑制H/R期间心肌细胞TNF α的表达 ;(3 )外源性ADO可能通过抑制心肌细胞NF κB结合活性下调TNF α的表达     

L-瓜氨酸对子痫前期中的氧化应激和滋养层细胞侵袭的调控机制研究

摘要 目的：研究L-瓜氨酸（L-Cit）对子痫前期（PE）大鼠模型的治疗作用,及其对氧化应激和滋养层细胞侵袭的影响。方法：建立N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）诱导的PE大鼠模型后,将大鼠分为Control组、PE组、PE+低、中和高剂量L-Cit组（依次为L-L-Cit、M-L-Cit和H-L-Cit组,剂量依次为100、200和500 mg/kg）,n=6,连续给药7 d。在孕第21 d时,检测各组大鼠收缩压（SBP）、24 h尿蛋白、血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平,并对胎盘组织进行苏木精伊红（HE）染色。将HTR-8/Svneo细胞分为Control组、缺氧/复氧（H/R）组、H/R+L-Cit组和H/R+L-Cit+sc-221593组,分别对细胞进行H/R处理,并使用L-Cit（200 μg/mL）和特异性ERK1/2抑制剂sc-221593（10 μmol/L）培养细胞48 h。通过Transwell测定细胞侵袭。通过Western blotting检测total-ERK1/2、p-ERK1/2、total-p38、p-p38、基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的蛋白表达。结果：与PE组比较,L-L-Cit组、M-L-Cit组和H-L-Cit组的SBP和24 h尿蛋白水平均降低（P<0.05）;胎盘组织形态明显改善;血清SOD升高,MDA降低（P<0.05）;胎盘组织中ERK1/2和p38的磷酸化水平及MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平均升高（P<0.05）。与H/R组比较,H/R+L-Cit组的侵袭细胞数量升高（P<0.05）;ERK1/2和p38的磷酸化水平及MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平均升高（P<0.05）。与H/R+L-Cit组比较,H/R+L-Cit+sc-221593组的上述变化均被逆转（P<0.05）。结论：L-Cit可能通过激活ERK/JNK通路减轻PE中的氧化应激并促进滋养层细胞侵袭,从而减轻PE症状。     

低氧后处理诱导的低氧诱导因子-1α表达上调减轻H9c2心肌细胞低氧/复氧损伤北大核心CSCD

本文旨在探讨低氧后处理(hypoxic postconditioning)对低氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)所致的心肌细胞损伤以及低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的影响,并分析二者之间可能的关系。利用H9c2心肌细胞株建立低氧/复氧和低氧后处理模型,通过测定细胞存活率、细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性及caspase-3活性来观察低氧/复氧造成的H9c2细胞的损伤,用Westernblot检测H9c2细胞内HIF-1α的蛋白水平,用real-timePCR检测细胞内HIF-1α的mRNA水平。结果显示,低氧后处理提高了低氧/复氧H9c2细胞的存活率,降低了LDH及caspase-3活性。同时,低氧后处理增加了H9c2细胞内HIF-1α的蛋白水平。预先利用HIF-1α脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG上调HIF-1α的蛋白水平后,由低氧/复氧导致的H9c2细胞的损伤明显减轻,其效应与低氧后处理完全一致。对H9c2细胞内HIF-1α蛋白水平与细胞存活率进行相关性分析,结果显示二者呈显著正相关(r=0.743,P<0.01);而运用siRNA方法抑制细胞内HIF-1α基因表达后,显著削弱了低氧后处理减轻低氧/复氧细胞损伤的效应。以上结果提示,HIF-1α表达上调是低氧后处理减轻细胞低氧/复氧损伤的机制之一。     

藏药镰形棘豆对缺氧/复氧H_9C_2心肌细胞损伤的保护作用

探讨藏药镰形棘豆(OFB)提取物对缺氧/复氧(H/R)H_9C_2心肌细胞损伤的保护作用。方法:采用三气培养箱培养法建立H_9C_2心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。实验分为3组:正常细胞对照组;缺氧/复氧损伤组(H/R);7个药物加缺氧/复氧损伤组(H/R+OFB);于缺氧/复氧开始时分别加入终浓度为0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、300 mg/L、600 mg/L、1 000 mg/L的镰形棘豆提取物,以细胞活力为指标,利用MTS法测定药物对细胞活力的影响。检测镰形棘豆乙酸乙酯水甲醇压柱组分与氯仿萃取组分不同给药剂量对H_9C_2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。结果:与模型组相比药物处理组显著升高缺氧/复氧H_9C_2心肌细胞活力(p0.05)。结论:藏药镰形棘豆对H_9C_2心肌细胞的缺氧/复氧损伤有保护作用。     

香草醛对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用研究

摘要 目的：探讨香草醛对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBI)的神经保护作用及机制。方法：参考Rice-Vannucci方法建立HIBI大鼠模型。HIBI大鼠建模后立即腹腔注射20 mg/kg（HIBI+20Van组）或40 mg/kg（HIBI+40Van组）的香草醛,每隔12 h给药,连续7 d。然后评估大鼠的神经行为及脑组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。对BV2小胶质细胞进行氧糖剥夺/复氧(OGD/R)处理,并用20 μM香草醛培养。通过Western blot及免疫荧光检测HMGB1、NF-κB p65、SIRT1、MyD88和TLR4的表达水平。通过乳酸脱氢酶（LDH）释放测定试剂盒测定用不同BV2细胞培养基处理的原代神经元的LDH释放。结果：与HIBI组比较,HIBI+20Van组和HIBI+50Van组新生大鼠的前肢悬吊时间和旷场得分均升高,脑组织中的IL-1β、IL-6和TNF-α的水平均降低。香草醛均升高了HIBI大鼠和OGD/R处理的BV2细胞质中的SIRT1的表达水平,降低了TLR4、MyD88和HMGB1的表达水平及细胞核中NF-κB p65的表达水平（P<0.05）。香草醛降低了原代神经元的LDH释放量（P<0.05）。结论：香草醛通过调节SIRT1/HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制HIBI引起的神经炎症,从而提高HIBI大鼠的神经功能。     

基于NF-κB通路探讨IRAK3基因表达对脂多糖诱导的心肌细胞损伤的作用及机制

摘要 目的：探讨白介素1受体相关激酶3（IRAK3）基因表达对脂多糖（LPS）诱导的心肌细胞损伤的作用及机制。方法：分离培养SD乳鼠原代心肌细胞,随机分为对照组、LPS组、siIRAK3组和siIRAK3+LPS组。siIRAK3组和siIRAK3+LPS组心肌细胞转染IRAK3沉默核糖核酸（siRNA）,对照组和LPS组转染阴性对照siRNA。转染48 h后LPS组和siIRAK3+LPS组分别用LPS（10 μg/mL）处理心肌细胞6 h,对照组和siIRAK3组加入等量的PBS溶液。采用免疫蛋白印迹法（Western blot）检测LPS对心肌细胞IRAK3表达的影响,采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测四组心肌细胞增殖,采用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测四组心肌细胞凋亡。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测四组心肌细胞上清液中炎症因子白介素（IL）-6、肿瘤坏因子（TNF）-α的水平。Western blot检测核转录因子-κB（NF-κB）蛋白和NF-κB抑制蛋白α（IκB-α）的表达。结果：Western bolt结果显示,LPS使原代心肌细胞IRAK3的蛋白表达升高（P<0.05）,CCK-8和TUNEL结果显示,与对照组相比,LPS组心肌细胞活力降低,心肌细胞凋亡比例升高（P<0.05）;siIRAK3组细胞活力和细胞凋亡比例与对照组相比均无明显差异（P>0.05）。与LPS组相比,siIRAK3+LPS组心肌细胞活力升高,心肌细胞凋亡比例降低（P<0.05）。与对照组相比,LPS组心肌细胞分泌的IL-6、TNF-α升高,NF-κB蛋白表达升高而IκB-α蛋白表达降低（P<0.05）。与LPS组相比,siIRAK3+LPS组心肌细胞炎症因子分泌减少,NF-κB蛋白表达降低,IκB-α蛋白表达升高（P<0.05）。结论：干扰IRAK3基因表达通过负向调控NF-κB通路减轻LPS诱导的大鼠原代心肌细胞损伤。     

MiR-21靶向调控Mfn2对缺血再灌注损伤肾小管上皮NRK-52E细胞自噬及凋亡的影响

摘要 目的：探讨miR-21对缺血再灌注损伤肾小管上皮细胞自噬及凋亡的影响及其与线粒体融合素2（mitochondria fusion protein mitofusin2,Mfn2）的靶向关系。方法：将大鼠近端肾小管上皮细胞株NRK-52E细胞按处理方式不同分组：I/R+control mimics组（转染control mimics后缺氧3 h/复氧3 h）,I/R+miR-21mimics组（转染miR-21mimics后缺氧3 h/复氧3 h）,I/R组（缺氧3 h/复氧3 h）及对照组（正常培养）。选取30只Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机分为假手术组、缺血再灌注模型组(I/R组)。取大鼠肾组织进行HE染色,自动生化分析仪检测大鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞增殖能力,TUNEL法检测细胞凋亡,实时荧光定量PCR检测细胞自噬和凋亡相关基因LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、Bcl-2、Bax及Mfn2 mRNA表达,Western blot法检测细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达,荧光素酶实验验证miR-21与Mfn2的靶向关系。结果：Sham组大鼠血清BUN、Cr水平,大鼠肾组织细胞凋亡率高于I/R组（P<0.05）。I/R组大鼠肾组织肾小管结构紊乱,大量炎症细胞浸润。Sham组大鼠肾组织miR-21水平高于I/R组（P<0.05）。48 和 72 h 时,I/R+miR-21 mimics组细胞活力明显低于I/R+control mimics组,I/R组及对照组（P<0.05）,I/R组细胞活力低于对照组（P<0.05）。I/R+miR-21mimics组凋亡率显著高于I/R+control mimics组,I/R组及对照组（P<0.05）,I/R组凋亡率显著高于对照组（P<0.05）。与对照组比较,I/R组细胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bax蛋白及基因mRNA表达量升高,Bcl-2蛋白及基因mRNA表达量降低（P<0.05）;与I/R组比较,I/R+miR-21mimics组细胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bax蛋白及基因mRNA表达量升高,Bcl-2蛋白及基因mRNA表达量降低（P<0.05）。miR-21与Mfn2具有靶向关系。结论：miR-21可靶向Mfn2促进肾缺血再灌注损伤引起的凋亡及自噬。     

番茄红素对大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧的保护作用以及其机制

目的:探讨番茄红素对心肌细胞缺氧复氧的保护作用以及其分子机制。方法:采用原代培养心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型,实验分8组:正常对照组,H/R组,H/R+番茄红素(1,2,4,8,16,32μmol/L)剂量组。观察各组细胞经H/R损伤后,细胞内天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的变化情况,选择正常对照组,H/R组,最佳番茄红素剂量组做MTT分析细胞凋亡,Western检测TRL 4以及NF-κB的表达。结果:番茄红素(16,8,4,2μmol/L)剂量组可显著降低缺氧/复氧损伤心肌细胞内AST、CK、LDH释放量及MDA的生成,并能提高SOD活性。此外番茄红素可减少心肌细胞缺氧/复氧损伤后的心肌凋亡,减少TRL 4受体以及NF-κB的表达。结论:番茄红素具有抗缺氧/复氧损伤,保护心肌细胞的作用,其机制可能是通过抑制TRL 4通路来实现的。     

内质网应激预处理对人正常肝细胞缺氧再复氧损伤的保护作用

目的:研究内质网应激预处理对人肝细胞缺氧复氧损伤的保护作用。方法:将培养的人肝细胞分为4组:正常对照(C)组、细胞缺氧复氧损伤(H/R)组、内质网应激(ER)组、内质网应激预处理(ERP+H/R)组。收集各组细胞,以流式细胞仪检测细胞凋亡,Western-bloting及RT-PCR检测内质网应激特异蛋白GRP78表达水平,并通过透射电镜观察各组细胞超微结构改变。结果:ERP+H/R组细胞凋亡率明显低于H/R组(P<0.05),ER及ERP+H/R组GRP78蛋白表达明显高于H/R组(P<0.05)。结论:内质网应激预处理对肝细胞缺氧复氧损伤具有明显的保护作用,内质网应激特异性蛋白GRP78可能在肝细胞缺氧复氧损伤中作为一种关键性的保护蛋白出现。     

线粒体大麻素受体1在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响

目的:探讨线粒体CB1受体(mitochondrial cannabinoid receptor1,mtCB1)在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响。方法:原代培养新生的Wistar大鼠海马神经元,将培养至第8天的海马神经元采用随机数字表分为5组(n=60):正常组(N组):正常培养,不做任何处理;缺氧复氧组(H/R组):采用氧糖剥夺法构建海马神经元缺氧复氧损伤模型,缺氧6h,复氧20 h;缺氧复氧组+ACEA+AM251组(H/R+ACEA+AM251组):缺氧6 h结束后立即加入ACEA和AM251,终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L,复氧20 h;缺氧复氧+ACEA+Hemopressin(H/R+ACEA+Hemo组):缺氧6h结束后立即加入ACEA和Hemopressin,终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L,复氧20 h;缺氧复氧+赋形剂组(H/R+V组):同样于缺氧6h结束后立即加入二甲基亚砜(DMSO),终浓度0.1%,复氧20 h。使用激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca~(2+)的浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡诱导因子(AIF)、线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1,细胞凋亡相关蛋白细胞色素C(Cytc)和Rho相关的卷曲蛋白激酶1(ROCK1)的表达。结果:与N组相比,H/R组、H/R+ACEA+AM251组、H/R+ACEA+Hemo组和H/R+V组的细胞内Ca~(2+)浓度、细胞凋亡率、以及AIF、Drp1、Fis1、Cytc、ROCK1蛋白的表达水平均明显增加(P0.05);与H/R组相比,H/R+ACEA+Hem组上述各检测指标明显降低(P0.05),H/R+ACEA+AM251组和H/R+V组各指标比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:线粒体CB1受体(mtCB1受体)可能通过降低细胞内ROS的含量来减少细胞内Ca~(2+)浓度和ROCK1的表达,进而抑制线粒体分裂,并最终减轻海马神经元缺氧复氧损伤。