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通育粳1号水稻乙醇脱氢酶基因克隆与原核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
克隆通育粳1号水稻乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,并在原核系统中进行体外表达。取通育粳1号水稻幼根,提取总RNA,RT-PCR法扩增ADH基因开放阅读框架片段,双酶切后连接至pGEX-4T-1表达质粒中。将质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中,平皿培养,挑取阳性菌落培养,提取重组质粒,酶切、电泳鉴定插入片段并测定其序列。pGEX-4T-1-ADH/BL21进行常规LB扩大培养,IPTG(1 mmol/L)作用2、3和4 h诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。结果显示,插入质粒中的ADH片段序列和方向正确无误,表达蛋白分子量符合预期值42 kD,表达至最大值的诱导时间为3 h。因此,该基因的成功克隆和表达为进一步研究水稻中ADH的作用和应用生物工程法大量获得ADH奠定基础。 相似文献
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将RAV-1囊膜基因gp85片段来克隆到表达质粒pET-21d( )中得到重组表达质粒pET-21d-RAV-1env(BelⅡ/SalⅠ)序列分析表明该插入片段的核苷酸序列和阅读框都与RAV-1囊膜基因相应序列相同。用其转化大肠杆菌BL21(DE)3并经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明RAV-1囊膜基因融合蛋白表达产物约20kD,与理论值相符;IPTG诱导起始时间比诱持续时间对表达量的影响更大。 相似文献
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重组人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx—BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83%的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性。 相似文献
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根据本实验室克隆的大黄鱼肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,通过RT-PCR法扩增大黄鱼MSTN成熟肽区域的基因,将目的片段插入pMD18-T克隆质粒,并测序验证。验证后用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切含目的片段的pMD18-T克隆质粒和pET-28 a表达质粒,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒。将重组表达质粒转化至BL21菌中,经IPTG诱导后表达蛋白的大小约17 kD。 相似文献
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用NooI/EcoRI酶切含α毒素基因质粒pXCPA02,回收1.2kb的α毒素基因片段,通过T4 DNA连接酶,将回收的α毒素基因片段与经NcoI/Eco RI酶切的表达载体pET-28c连接,转化至受体菌BI21(DE3)中,经NcoI/EcoRI,BamHI/Eco RI和NcoI/BamHI/Eco RI酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实,获得的表达质粒aXETA02含有α毒素基因,而且阅读框架是正确的.重组菌株BL21(DE3),(pXETA02)经IPTG诱导后,其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达α毒素蛋白,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的36.83%. 相似文献
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目的:在原核载体中克隆、表达花生主要变应原Ara h2,为其重组变应原应用研究奠定基础。方法:合成花生主要变应原Ara h2基因,设计特异性引物行PCR扩增,经Eco RⅠ、HindⅢ双酶切后与做相应酶切的pET-28a载体连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序分析,使用IPTG诱导融合蛋白表达,使用Ara h2特异性多克隆抗体对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果:成功扩增了Ara h2基因,重组质粒双酶切见目的条带,基因测序显示Ara h2在正确开放阅读框中,基因长423bp,编码140个氨基酸,预测的等电点为5.3,分子量约16660.17 Da,基因比对分析显示其与相关报道的核苷酸序列一致性达100%。重组pET-28a-Ara h2/BL21经0.6 mmol/L IPTG诱导表达可见重组融合蛋白在相应分子量大量表达,使用Ara h2多克隆抗体免疫印迹法能检测到目的蛋白。结论:成功克隆、表达了花生主要变应原Ara h2,为其重组变应原应用研究奠定了基础。 相似文献
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D A Galton 《BMJ (Clinical research ed.)》1971,2(5757):323-324
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Kai Larsen 《Nordic Journal of Botany》1996,16(6):636-636
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