融合淀粉酶AmyP-Clo对大米生淀粉的高效降解

【目的】获得能高效降解大米生淀粉的α-淀粉酶。【方法】将来源Clostridium butyricum T-7的α-淀粉酶的淀粉结合结构域与能快速偏好性降解大米生淀粉的α-淀粉酶Amy P的催化结构域融合重组表达。【结果】融合蛋白Amy P-Clo保留了野生型Amy P催化优势的基础上,对大米生淀粉的比活为(373.9±8.4)U/mg,4 h内对5%大米生淀粉的最终降解率为(42.7±1.1)%,对大米生淀粉的最高结合率为(71.1±1.6)%,这些数据相比Amy P分别提高了3.1、2.8和1.3倍。【结论】融合蛋白Amy P-Clo能高效降解生大米淀粉,是一个具有优良应用价值的酶。     

嗜盐碱性淀粉酶产生条件和性质的初步研究

从我国内蒙古自治区察汗淖碱湖分离到一株能产胞外嗜盐碱性淀粉酶的极端嗜盐嗜碱杆菌(Natronobacterium sp.)C-212,该菌产酶的最适pH和NaCl浓度分别为9.5和20%,最适碳源为可溶性淀粉,氮源为复合蛋白胨.酶反应最适温度为50℃,pH为8.5,NaCl浓度为2.6mol/L,该酶在pH9.5最稳定,NaCl可增加酶的热稳定性,酶降解可溶性淀粉的主要产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖及其他寡糖.     

2种不同形态不依赖Ca2+ α-淀粉酶的纯化与表征

纯化表征了枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis CN7产生的2种不同形态的不依赖Ca2+的α-淀粉酶,对其酶解产物进行了高效液相色谱(HPLC)分析。结果表明:通过加热除杂、超滤、(NH4)2SO4沉淀和分子筛层析,一次性获得了纯化倍数提高36倍的电泳纯成熟肽形式α-淀粉酶Amy7B和提高75倍的截短体形式α-淀粉酶Amy7S;Amy7B和Amy7S的最适pH为6.5,最适温度为65℃,酶活性均不依赖于乙二胺四乙酸(EDTA)和Ca2+;酶解产物主要由葡萄糖和麦芽糖组成。Amy7B的相对分子质量为6.7×104,半衰期温度为59.6℃,比活力为(905.99±96.52)U/mg。与之相比,Amy7S的相对分子质量小约2.0×104(为4.7×104),半衰期温度高2.7℃(为62.3℃),比活力高1.05倍(达到(1 853.87±75.61)U/mg)。     

鉴定隶属于糖苷水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13, GH13)的潮滩发光杆菌的β-半乳糖苷酶

【背景】糖苷水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13, GH13)是已知最大的α-淀粉酶家族,不含有半乳糖苷酶。【目的】对海洋细菌潮滩发光杆菌(Photobacterium gaetbulicola)的一个蛋白BgalPg进行鉴定。【方法】通过保守位点分析和系统发育树确定BgalPg蛋白的家族分类;通过克隆、表达和纯化测定重组BgalPg蛋白的酶学性质并鉴定功能。【结果】BgalPg的蛋白序列新颖,与已知的碳水化物酶无同源性。序列分析结果表明该蛋白具有GH13家族的典型特性,并且隶属于GH13＿38亚家族。BgalPg对α-淀粉酶家族酶的相关底物均无催化活性,却能水解含有β-半乳糖苷键的底物p NP-β-Gal [(2.8±0.4) U/mg]和o NP-β-Gal [(1.4±0.3) U/mg],并且能水解乳糖[(0.40±0.01) U/mg],表现出典型的β-半乳糖苷酶活性。同时,该酶在pH 7.0–8.5稳定性好,60℃的半衰期为1.5 h。【结论】发现隶属于GH13家族的β-半乳糖苷酶。     

Rhodococcus erythropolis 手性醇脱氢酶的克隆表达及其性质

【目的】探讨红串红球菌中一种醇脱氢酶的性质及其对酮酯类及酮类底物的催化能力。【方法】从红串红球菌(Rhodococcus erythropolis ATCC 4277)中获取一段长度为1047 bp的醇脱氢酶(adh)基因,插入载体pET-22b(+)后,在大肠杆菌中进行重组表达。15℃的低温下用自诱导培养基诱导24 h,以苯乙酮为底物测定醇脱氢酶酶活。【结果】测得该诱导条件下重组菌体细胞破碎上清中醇脱氢酶酶活力为2.6 U/mg。经温度、pH耐受性等分析,发现该酶最适pH在6.0-6.5之间,耐受温度可以达到60℃,并且在该温度下保持5 h后,酶活也能保留80%。对于β酮酯类底物的催化反应,以对乙酰乙酸乙酯的催化能力最高。用4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为底物进行全细胞水相催化反应,经手性液相色谱分析,发现在催化产物以R型4-氯-3羟基丁酸乙酯(CHBE)为主。【结论】该酶在酮酯类的底物转化方面有良好的开发潜力及应用前景。     

超耐热酸性α-淀粉酶基因在多型汉逊酵母中表达及与在毕赤酵母中表达的比较研究

利用毕赤酵母的质粒载体pPIC9K将极端耐热古菌Pyrococcusfuriosus的超耐热酸性α-淀粉酶(Amy)基因转化到多型汉逊酵母HP-6中,获得重组汉逊酵母。经过甲醇进行诱导,表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳,证明α-淀粉酶(Amy)在多型汉逊酵母中利用AOX1启动子和α-因子信号肽有效表达并分泌到胞外。该酶的最适反应温度为90～100℃,最适作用pH为4.0～5.0,较之重组毕赤酵母的最适作用pH还低0.5。此外与毕赤酵母的重组蛋白相比,重组汉逊酵母α-淀粉酶不仅菌株筛选简便、周期短,而且具有更容易筛选到高拷贝转化子以及适用于大规模工业发酵等优点。     

重组超耐热酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

基因工程菌所产生的重组超耐热酸性α-淀粉酶,通过超滤浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到电泳纯的超耐热酸性α-淀粉酶,纯化倍数为11.7,活力回收率为29.8%。用SDSPAGE测得该酶的分子量为55kD,酶的等电点pI(室温)为5.0,以可溶性淀粉为底物的Km值为1.12gL,用硫酸酚法测得其含糖量为15.4%。该酶的最适反应温度为95℃,最适反应pH值为4.5。在pH4.0～7.0室温放置48h酶活没有变化,110℃保温1h残留60%活力。Cr3 、Fe2 、Cu2 抑制酶的活性,Ca2 对酶活无影响。EDTA和DTT对酶的活性无影响。     

一株产生淀粉酶杆菌Bacillus sp. GEL-09的筛选、鉴定及发酵条件优化

【背景】生淀粉酶可以水解生淀粉颗粒,在酒精发酵、白酒、黄酒和食醋的生料酿造工业中具有广阔的应用前景。【目的】从自然环境中筛选产生淀粉酶的菌,对其发酵条件及酶性能进行考察,为淀粉生料发酵过程提供优良菌种和酶资源。【方法】取木薯田土壤,经过稀释、热处理、富集培养以及木薯淀粉平板筛选培养基初筛,摇瓶复筛得到产高效降解生淀粉酶的菌株;经过菌落形态、细胞染色观察以及16S rRNA基因序列比对进行鉴定;对筛选菌株的发酵培养基和发酵条件进行优化,并对酶蛋白进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】分离到一株具有较高生淀粉酶水解活力的菌株GEL-09,经鉴定为芽胞杆菌Bacillus sp.GEL-09;该菌在最优发酵条件下培养96 h,胞外酶活力达到430.6 U/m L,是优化前的2.8倍;酶学性质分析发现该酶为中温、中性酶,最适温度和p H为50°C和7.0;生淀粉降解能力对比发现,该酶的生淀粉降解能力值为62.3%,显著高于细菌α-淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶和甘薯β-淀粉酶对生淀粉的降解能力。【结论】Bacillus sp.GEL-09在生淀粉酶生产方面具有良好的开发应用前景。     

海鲍分离微生物Acinetobacter sp.酯酶基因的表达和酶学性质

【目的】克隆源于海鲍内脏中一株不动杆菌Acinetobacter sp.的酯酶基因estA,并对其进行重组表达和性质研究。【方法】利用分子生物学技术克隆出酯酶基因estA并构建pPICZα-C-estA重组表达载体,并通过电转化方法将重组质粒转入毕赤酵母X33中;通过甲醇诱导培养重组菌获得重组酯酶,并对重组酯酶进行生化表征。【结果】克隆得到的estA基因序列全长912 bp,编码304个氨基酸;重组X33发酵上清液中酯酶酶活力达到1 200 U/L,重组酯酶的分子量约为33.7 kD;酶学性质研究表明重组酯酶催化底物对硝基苯乙酸乙酯水解反应的最适pH和温度为8.0和40?C,在pH 8.0-10.0温度及小于60?C时具有较好的稳定性。【结论】成功克隆了海洋来源的不动杆菌酯酶基因并在Pichia pastoris中实现了高效表达。     

Aspergillus sp. RSD生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质

【目的】纯化得到一种生淀粉糖化酶,并对其酶学性质进行分析。【方法】从曲霉RSD发酵液中,经过硫酸铵分级盐析,HiPrep DEAE FF16/10弱阴离子交换层析,凝胶过滤层析,Hiprep 16/10 source 30S阳离子交换层析最终纯化出一种电泳纯的生淀粉酶。【结果】粗酶液纯化倍数为12.65倍,活力回收率为9.02%,SDS-PAGE结果显示该酶的相对分子质量约为82 kD。对该酶的酶学性质分析结果表明,该酶最适作用温度为50°C,在50°C以下稳定性很好,对高温较为敏感;最适作用pH为4.5,在pH 3.5-7.0范围内酶活力较为稳定,在40°C、pH 4.6条件下以可溶性淀粉为底物时的Km值和Vmax值分别为7.44 g/L和1.45 g/(L·min);金属离子对酶活性的影响试验表明,Fe2+对该酶具有显著激活效果,EDTA、Cu2+、K+对该酶酶活力有不同程度的抑制作用;底物特异性研究表明该酶对麦芽糊精具有较高酶活力。【结论】与市售糖化酶及生淀粉糖化酶相比,该酶对生淀粉的降解能力更高,在工业应用上有较好的前景。     

蜡样芽胞杆菌GXBC-3三个普鲁兰酶基因的表达及其酶学特性

探索获得优良的新型普鲁兰酶基因,丰富普鲁兰酶理论,对实现普鲁兰酶国产化具有重要意义。分析GenBank数据库中蜡样芽胞杆菌假定Ⅰ型、Ⅱ型普鲁兰酶基因序列,从实验室保藏的蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus GXBC-3中克隆得到3个普鲁兰酶基因pulA、pulB、pulC,并分别导入大肠杆菌进行胞内诱导表达。纯化重组酶酶学性质研究表明重组酶PulA能水解α-l,6-和α-l,4-糖苷键,为Ⅱ型普鲁兰酶,以普鲁兰糖为底物时,最适反应温度及pH分别为40℃和6.5,比活力为32.89 U/mg;以可溶性淀粉为底物时,最适反应温度及pH分别为50℃和7.0,比活力为25.71 U/mg。重组酶PulB和PulC二者均只能水解α-l,6-糖苷键,为I型普鲁兰酶,以普鲁兰糖为底物时,其最适反应温度及pH分别为45℃、7.0和45℃、6.5,比活力分别为228.54 U/mg和229.65 U/mg。     

乳酸乳球菌Nisin抗性基因nisI的克隆及作为筛选标记的研究

摘要：【目的】为了优化LJ1菌株的培养条件使之产生高活性的胞外褐藻胶裂解酶。【方法】通过富集培养技术从海带筛选到一株褐藻胶裂解酶产生菌LJ1, 依据表型特征、脂肪酸组成分析及16S rRNA基因序列分析对该菌株进行鉴定。通过单因子和正交试验对LJ1 菌株产胞外褐藻胶裂解酶的培养条件进行了优化。【结果】LJ1菌株属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）。该菌株产酶的最佳培养基组成为：褐藻胶3 g/L、(NH4)2SO4 3 g/L、NaCl 20 g/L、KH2PO4 0.1 g/L、CaCl2 0.1 g/L;最佳培养条件为：250 mL三角烧瓶中装液量25 mL、接种量3%、摇瓶转速150 r/min、pH7.5、培养温度为28℃、培养时间为24 h。LJ1菌株所产褐藻胶裂解酶的最适温度为40℃,最适pH7.6,最适NaCl浓度为0.3 mol/L。1 mol/L金属离子Mg2+对酶活力有明显的促进作用,而Co2+ 和Zn2+对酶活力有较强的抑制作用。【结论】LJ1菌株是Pseudoalteromonas 新的胞外褐藻胶裂解酶产生菌,在最佳培养条件下,该菌株的酶活力提高了66%。     

南极海冰细菌中产低温 α-淀粉酶菌株的发酵和酶学特性的初步研究

从147株南极海冰细菌中筛选出一株高产低温a-淀粉酶的菌株Pseudoalteromonas sp.AN175。生长发酵单因素试验表明,菌株AN175在1%麦芽糖、0.5%酵母粉、0.01%磷酸铁、0.5%氯化钙、1%可溶性淀粉、5%NaCl、pH 6.0的培养基,10℃,30%装液量,130 r/min条件下振荡培养9 d可达到最大酶活132.5 U/mL,为优化前的2倍多。生长和产酶试验表明,该菌生长较常温菌缓慢,酶分泌时间滞后。粗酶特性研究显示,该酶催化的最适条件为温度30℃,pH值8.0。     

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温α-淀粉酶(amyE)基因进行改造获得的基因突变体(amyEM),通过PCR扩增,将此基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pBV220和毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并分别转化大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组大肠杆菌和重组毕赤酵母。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE分析,证明突变α-淀粉酶(AmyEM)在大肠杆菌、毕赤酵母中获得有效表达。对重组大肠杆菌产生的α-淀粉酶的粗酶性质分析表明,此酶分子量约为55kDa。其最适反应温度为80℃~90℃,与野生型基因相比,其最适pH均为6.0,但不同的是突变体在pH 5.0~5.5时表现出较高的酶活力;在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。由于酵母可对蛋白进行糖基化,酶分子量增加到60kDa,最适pH也改变为5.5。此高温α-淀粉酶突变体所具有的在微酸性环境具有较高酶活力的性质,具有重要的潜在工业应用价值。     

芽孢杆菌WS-3L淀粉酶的纯化和特性的研究

芽孢杆菌WS-3L产生的α-淀粉酶AmyL经过多步纯化,酶的回收率为15.5%,比活提高了345倍.该淀粉酶能够有效水解淀粉生成麦芽寡糖.酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为6.5,在pH 7.0～8.0,40℃以下酶活较稳定;离子Cu2 、NH4 、Ag 、Hg 和EDTA、SDS对酶活力有显著抑制作用,而其他一些常见金属离子如Na 、K 则对酶活影响不大.AmyL对可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉的Km值和Vmax分别为2.81 mg/mL、8.37 mg/mL、1.80 mg/mL和11.67 μmol/(min·mL)、10.00μmol/(min·mL)、13.33 μmol/(min·mL),表明支链淀粉是该酶的理想水解底物.玉米淀粉对AmyL有很高的吸附率,预示这可以作为酶快速固定的一个简易方法应用到实际生产中.     

植物乳杆菌源胺氧化酶的异源表达及功能结构分析

【目的】生物胺是一类广泛存在发酵食品中潜在有害物质,可被胺氧化酶分解。本研究对来源于乳酸菌的胺氧化酶的酶学性质及其降生物胺能力进行了探究。【方法】本研究在大肠杆菌中异源表达了植物乳杆菌中多铜氧化酶基因SufI,经过优化表达条件与纯化重组酶后,分析了该酶的最适反应条件、酶稳定性、降生物胺能力、光谱与结构特性。【结果】重组酶的最适pH值为3.5,最适温度为20℃,在pH 4.0–10.0或15–65℃的条件下,相对酶活力保持在70%以上。重组酶具有较好的稳定性,酶活不受乙醇等抑制剂的影响。在8种生物胺的混合体系内,重组酶对生物胺总量的降解量可达403.23μg/mL,其中对酪胺的降解量最多,超过70μg/mL (34.99%)。在单一生物胺体系内,重组酶对酪的底物亲和性较高,酶活可达18.33U/mL。紫外-可见扫描光谱显示酶蛋白在600 nm处有多铜氧化酶家族特征吸收峰,傅里叶红外光谱解析酰胺Ⅰ带中α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲的相对含量分别为21.52%、20.72%、33.80%和23.97%。同源建模预测该酶具有3个铜结合域,且含有组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和谷氨酸等铜配体结合...     

新型耐热β-1,4-木糖苷酶的重组表达及酶学性质

【目的】拟对来源于热解纤维素果汁杆菌的新型β-木糖苷酶基因(CoXyl B)进行重组表达和酶学性质研究。【方法】在大肠杆菌系统中成功表达CoXyl B基因,并通过镍柱亲和层析、强阴离子交换和凝胶层析等纯化方法获得纯酶。【结果】对CoXyl B酶学性质的研究结果显示,在以4-对硝基苯酚-β-D-木糖苷为底物时,该酶的最适反应温度为90℃,最适反应pH为6.0。在40–70℃范围内CoXyl B酶活较高且比较稳定。在pH 5.0–6.0之间,70℃孵育1 h后,CoXyl B的相对酶活仍保留80%以上。Ag~+、高浓度的SDS和PMSF对酶活力的抑制作用较显著,而高浓度Mg~(2+)、Li~+和EDTA对酶活力的激活作用较为明显。CoXyl B的k_(cat)和K_m值分别为5.0×10~(–3)s~(–1)和1.9 mmol/L。薄层层析色谱显示CoXyl B具有降解木二糖、木三糖和木四糖的能力。【结论】本研究鉴定出CoXyl B为一种新型的极端耐热木糖苷酶,CoXyl B的酶学性质研究将为其在食品热加工以及生物降解领域中的应用提供参考。     

腊样芽孢杆菌低温淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

从废弃的淀粉堆中筛选到一株产低温淀粉酶的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GXBC-1,通过同源保守序列比对,从中克隆到一个淀粉酶基因.该基因全长为1764bp,编码588个氨基酸,分子量约为64kD.将基因克隆到大肠杆菌进行表达及酶学性质研究,该重组酶最适温度为35℃,在20℃仍具有53%的活力;最适pH...     

鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造

【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH 6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50 °C,在此温度下保温1 h酶活无显著变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。     

α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。