胰蛋白酶与底物在尿素溶液中的结合

胰蛋白酶的专一性底物,对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯,对酶在236mμ的尿素差吸收峰有熄灭作用;不同量的对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯对胰蛋白酶236mμ的尿素差吸收值的影响形成一滴定曲线。在8M尿素溶液中对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯和胰蛋白酶的旋光不具有加和性。这些事实说明在尿素溶液中胰蛋白酶能够和底物结合。二异丙磷酰胰蛋白酶的236mμ尿素差吸收峰亦能被对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯熄灭,指出二异丙磷酰胰蛋白酶仍然具有和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯结合的能力。用N-溴代琥珀酰亚胺氧化胰蛋白酶的色氨酸残基后,酶的尿素差示光谱消失以及酶的pH差示光谱中反映了一个pK2.8的解离基团,说明色氨酸残基和羧基可能直接或间接与236mμ左右的差示光谱有关。从底物存在下胰蛋白酶在pH1.6—3.6范围内不再呈现pH差示光谱看来,羧基可能参与底物的结合。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶的变性和失活动力学研究

用紫外差吸收和萤光方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物的SDS变性动力学研究结果表明,不论对于全酶、酶朊、羧甲基化酶,还是光照酶,在酶浓度为5μM,SDS的浓度为6.24mM,25℃恒温条件下,测量差吸收ΔA_(295)随时间的变化,或在λ_(ex)=305nm,λ_(em)=335nm测萤光强度随时间的变化,其结果均表现为由三个简单一级反应组成的复合一级反应,三个速度常数,对于上述四种酶来说尽管各不相同,但它们的数量级分别为:k_1=1秒~(-1),k_2=10~(-2)秒~(-1),k_3=10~(-3)秒~(-1)。这表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶每个亚基中的三个色氨酸由于所处的空间位置的不同,在空间结构发生变化时,分别以不同的速度由酶蛋白分子内部的非极性环境暴露于其外部的极性环境。另外还发现,在这四种酶中,全酶的变性速度最小,而羧甲基化酶的变性速度最大。这说明酶经羧甲基化后空间结构的稳定性减弱,因而更易于为SDS变性。与此同时,我们测定了全酶和酶朊的SDS失活过程,并同它们的变性过程进行了比较。从酶的失活过程类似于变性过程也是由三个一级反应组成的复合一级反应这一事实来看,全酶和酶朊的失活过程似有部分变性并具有部分活力的中间物存在。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶的变性和失活动力学研究

用紫外差吸收和萤光方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物的SDS变性动力学研究结果表明,不论对于全酶、酶朊、羧甲基化酶,还是光照酶,在酶浓度为5μM,SDS的浓度为6.24mM,25℃恒温条件下,测量差吸收ΔA_(295)随时间的变化,或在λ_(ex)=305nm,λ_(em)=335nm测萤光强度随时间的变化,其结果均表现为由三个简单一级反应组成的复合一级反应,三个速度常数,对于上述四种酶来说尽管各不相同,但它们的数量级分别为:k_1=1秒~(-1),k_2=10~(-2)秒~(-1),k_3=10~(-3)秒~(-1)。这表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶每个亚基中的三个色氨酸由于所处的空间位置的不同,在空间结构发生变化时,分别以不同的速度由酶蛋白分子内部的非极性环境暴露于其外部的极性环境。另外还发现,在这四种酶中,全酶的变性速度最小,而羧甲基化酶的变性速度最大。这说明酶经羧甲基化后空间结构的稳定性减弱,因而更易于为SDS变性。与此同时,我们测定了全酶和酶朊的SDS失活过程,并同它们的变性过程进行了比较。从酶的失活过程类似于变性过程也是由三个一级反应组成的复合一级反应这一事实来看,全酶和酶朊的失活过程似有部分变性并具有部分活力的中间物存在。     

SNase R在胍变性过程中构象与活力变化的比较

以紫外差光谱、荧光光谱为监测手段对金黄色葡萄球菌核酸酶类似物(SNase R)在胍溶液中构象与活力变化进行了比较.SNase R在Llmol L0.8mol L和0.5mol L胍溶液变性时变性过程均为两个一级反应,但是酶在上述胍浓度下失活的速度远快于构象变化的速度:酶在同一胍浓度下活力丧失的程度也远快于构象变化的程度.上述结果表明:SNase R的活性部位可能位于柔性较大的区域.     

盐类对二苯胺法脱氧核糖核酸定量测定的干扰作用

(1)DNA二苯胺反应受碱、盐类和高浓度的某些強酸的干扰,干扰作用都随浓度之增大而加強,但不同物貭的浓度-干扰曲綫不同,对显色产物的吸收光譜影响也不同。(2)卤化物中氯化物如NaCl、KCl、NH_4Cl、MgCl_2、MnCl_2以及HCl在最終浓度为0.1N时即可使显色值(600mμ)下降15%左右。NaF在0.25N以下对显色并无干扰。NaBr在0.05N,NaI在0.002N即可使显色值下降50%左右。卤化物对显色产物吸收光譜的影响除600mμ高峯下降之外还有520mμ新吸收高峯的出現。(3)一般鈉盐如Na_2SO_4、NaAc、NaOH、NaH_2PO_4、Na_2HPO_4、Na_3PO_4、柠檬酸鈉、三氯乙酸鈉皆对显色有显著干扰。但磷酸、柠檬酸、三氯乙酸则皆无干扰作用。这些鈉盐对显色产物吸收光譜的影响除600mμ高峯的下降外,还有480mμ新高峯的出現。(4)其它金属盐类如NH_4Ac、Mg(Ac)_2、(NH_4)_2SO_4、MgSO_4、ZnSO_4、MnSO_4也有不同程度的干扰作用。銨盐、鎂盐的作用都稍強于相应的鈉盐,对吸收光譜的影响則与一般鈉盐相类似。(5)強酸如H_2SO_4和HClO_4在高浓度时也有干扰作用,而NaHSO_4、NaClO_4反无干扰作用,它們对吸收光譜的影响都是只有600mμ吸收高峯的下降,并无新的高峯出現。(6)除卤化物以外的一般盐类和碱的干扰作用,在浓度不超过1N的情况下,都可以用适当提高二苯胺試剂中硫酸含量的方法定量的予以消除。反应产物吸收光譜的形状也可完全恢复。用这种改进的試剂对DNA显色值的大小,对显色后的稳定性以及反应的特异性都影响不大,实际可用。上述高浓度強酸的干扰作用則可用先加碱中和的方法予以消除。(7)HClO_4可完全代替二苯胺試剂中的H2SO_4,DNA的显色值不变,HClO_4也同样有消除卤化物以外一般盐类以及碱对显色的干扰作用。(8)上述盐类、碱以及高浓度的强酸的干扰作用是应用二苯胺反应进行有关DNA定量中必須考虑的因素。     

底物对LDS变性肌酸激酶的修复作用

本文报导了底物能够诱导变性肌酸激酶活力和构象部分恢复的实验事实.92μm免肌酸激酶用47mMLDS在pH9.0的甘氨酸缓冲液中变性半小时,取1μl变性酶至2ml底物系统中,10分钟后可观察到酶活力的再现:半小时可达对照酶活力的10%.当把此变性酶液按同样倍数稀释至与测活系统相同的缓冲液中,不同时间取样测活,则观察不到活力再现.可见,前述活力再现来自底物对变性酶的作用.底物对变性酶修复后的活力随着变性程度的减小而增大.底物可使低浓度LDS变性酶活力恢复至天然酶水平.ATP对构象修复起着主要作用.     

胍变性肌酸激酶复性复活过程中构象与活力的比较研究

本文讨论了经3M盐酸胍变性的兔肌肌酸激酶复性和复活的动力学过程,对二者进行了比较,以期从量的关系上研究酶的构象与催化活力之间的关系。从萤光和紫外差吸收光谱的变化看,复性过程基本上是变性过程的逆转。变性肌酸激酶复性遵循一级反应方程,以萤光强度变化为标志的速度常数k=2.2×10~(-3)秒~(-1)。酶复活过程却表明由两个一级反应所组成,其速度常数分别为k_1=0.97×10~(-3)秒~(-1),k_2=0.17×10~(-3)秒~(-1)。可见构象变化速度与复活过程中较快的反应速度相近。这说明在反映色氨酸及酪氨酸微环境的构象变化基本完成之后,活力恢复的过程还没有终结。可以认为兔肌肌酸激酶的构象与活力密切相关,酶的构象完整是催化活力的基础。     

胍变性肌酸激酶复性复活过程中构象与活力的比较研究

本文讨论了经3M盐酸胍变性的兔肌肌酸激酶复性和复活的动力学过程,对二者进行了比较,以期从量的关系上研究酶的构象与催化活力之间的关系。从萤光和紫外差吸收光谱的变化看,复性过程基本上是变性过程的逆转。变性肌酸激酶复性遵循一级反应方程,以萤光强度变化为标志的速度常数k=2.2×10~(-3)秒~(-1)。酶复活过程却表明由两个一级反应所组成,其速度常数分别为k_1=0.97×10~(-3)秒~(-1),k_2=0.17×10~(-3)秒~(-1)。可见构象变化速度与复活过程中较快的反应速度相近。这说明在反映色氨酸及酪氨酸微环境的构象变化基本完成之后,活力恢复的过程还没有终结。可以认为兔肌肌酸激酶的构象与活力密切相关,酶的构象完整是催化活力的基础。     

甲醇对胰蛋白酶催化活性影响的机理研究

为了探索甲醇影响胰蛋白酶催化活性的作用机理,将胰蛋白酶纯化到电泳纯的水平,用纯酶进行了催化动力学研究;测定了酶分子的紫外吸收光谱、紫外差示光谱和荧光发射光谱的变化.试验结果表明:胰蛋白酶经7%甲醇处理时,其比活力比对照提高了17.97%.经甲醇处理后的胰蛋白酶,其动力学参数Km值及Vmax值均得到提高,且Vmax提高幅度比较大.甲醇处理后,酶的紫外吸收光谱基本没有变化,其差示光谱出现明显的正峰和负峰,而其荧光发射光谱也基本不变,只是荧光强度有所增加.实验结果证明,在7%甲醇存在下,胰蛋白酶分子构型不变,酶活性的变化是甲醇引起酶分子构象改变的结果.     

在过量巯基化合物存在时蛋白质中巯基的测定

萘醌与巯基化合物如巯基乙酸、乙硫醇和谷胱甘肽等有当量加成关系。加合物在波长420mμ左右有一吸收峯。虽然改变測定时的溶剂系統或酸碱度会影响此吸收峯位置及高度,但在同一測定条件下光密度增值与巯基浓度的关系符合Beer定律。比較不同巯基化合物(包括巯基乙酸、谷胱甘肽及一些还原型蛋白貭中的巯基)与萘醌反应后光譜性貭的結果,它們的吸收峯位置及消光系数均大致相同。在18N H_2SO_4中每一巯基的毫克分子消光系数皆接近1.9 mM~(-1)巯基。利用巯基乙酸-萘醌加合物可以被乙醚抽提去淨的性貭,可以在过量巯基乙酸存在时测定蛋白貭中的巯基。在过量巯基乙酸存在时测定谷胱甘肽的結果与后者单独测定时完全相同。应用此法测定胰島素被过量20倍巯基乙酸在30℃,pH5,8M脲素水溶液內还原的过程,結果說明,胰島素三个硫硫鍵在6小时內可以定量地轉变为巯基。     

菠菜类囊体LHC的叶绿素-蛋白中的叶绿素排列和方向的研究

用蔗糖梯度离心的方法,从胰蛋白酶处理叶绿体和对照叶绿体膜分离LHC。比较研究了它们的吸收光谱、荧光光谱、圆二色光谱和荧光偏振度的变化。观测到消化叶绿体LHC的吸收光谱除位于652nm的肩消失外,其它特征性吸收均无明显改变,荧光发射峰位和在670nm的C.D.信号峰位与对照相比发生偏移,叶绿素b和吸收≤670 Nm叶绿素a的荧光偏振度降低。结果说明含叶绿素b的蛋白和短波长叶绿素a的蛋白位于类囊体膜的外侧,胰蛋白酶消化引起LHC的构型改变,从而使色素与色素、色素与蛋白的相互关系及叶绿素分子排列和方向发生改变。讨论了LHC上蛋白构型、叶绿素分子机构和叶绿素分子间能量传递的相互关系。提出了蛋白质在色素能量传递过程中的作用。     

固定化胰蛋白酶的快速制备

目的：快速制备高活力的固定化胰蛋白酶,用于转肽反应。方法：将壳聚糖与硅胶搅拌均匀,同时用戊二醛进行活化制成活化载体,再通过交联反应将胰蛋白酶固定至载体制备固定化胰蛋白酶。用正交法进行优化。结果：用快速工艺制得的固定化胰蛋白酶的活力单位为5990．5U/g,活力回收为16．7％,整个制备过程耗时21h。结论：快速工艺的制备过程较之改进前更为快捷简便,制备的固定化胰蛋白酶活力单位显著提高,利于工业应用。     

血红素与异咯嗪单核苷酸的分子络合物

血红素与FMN反应后的差光谱在500mμ—800mμ范围内有三个差吸收峰,波长分别为525mμ,610mμ及685mμ。用所谓连续变易法作图结果表明反应产物包括:血红素比FMN等于1:1,1:2及1:4等三种络合物,结合紧密程度依次降低。老化血红素与FMN反应只能产生1:1的络合物,表现出一个差吸收峰(585mμ)在过量连二亚硫酸钠存在下差光谱形状略为不同,血红素及FMN皆为全还原型时,络合物络合能力降低一个数量级。在隔绝空气的条件下逐步加入还原剂可以观察到在二者未完全还原前可能尚有其他络合物的生成。无论血红素是否经过老化它与FMN络合生成的产物差光谱皆受溶液离子强度的影响。对血红素与FMN络合的物质进行了讨论,所生成的某些络合物很可能是属于所谓电荷转移形式。这两种生物氧化中重要辅基如生成电荷转移络合物,可能与呼吸链中的电子传递有密切关系。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对棉铃虫幼虫消化生理和生长发育的影响

本研究根据棉铃虫Helicotverpa ormigera(Hubner)幼虫中肠蛋白酶在离体条件下对蛋白酶抑制剂的反应,选择具有较强抑制作用的大豆胰蛋白酶抑制剂,以0.21-4.2%(干重)的浓度配入幼虫人工饲料,测定了幼虫短期和长期取食这些饲料引起的中肠类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力的变化和生长抑制效应。短期取食抑制剂的幼虫,中肠弱碱性类胰蛋白酶活力显著增高,在4.2%。浓度下比对照高出21%;强碱性类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,生长发育受到明显抑制。长期取食低浓度(0.84%)抑制剂的幼虫,弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力显著增高,强碱性类胰蛋白酶活力显著降低。总蛋白酶活力变化不显著;长期取食高浓度(4.2%)抑制剂的幼虫,强碱性类胰蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,其它酶活力变化不显著。抑制剂随浓度的增高对幼虫生长的抑制作用加强,但浓度高于0.84%后,抑制强度的变化减小。据此作者认为,蛋白酶抑制剂对昆虫抗营养效应在于它对蛋白酶的激活和抑制作用,从而导致各种蛋白酶间的协调性破坏,昆虫消化过程受阻,影响生长发育。     

蛋白质功能基团的改变与其生物活力的关系 Ⅲ.对硝基苯酰甲基溴对某些蛋白质活力的影响

对-硝基苯酰甲基溴(NPAB)在不太高的浓度之下对木瓜蛋白酶,核糖核酸酶,胰凝乳蛋白酶和胰島素等的生物活力有明显的抑制作用。当NPAB与胰島素或胰疑乳蛋白酶共同保温时,随着生物活力的下降也同时发生吸收光譜的变化。对于胰凝乳蛋白酶而言,355mμ光密度的增加与其活力的下降完全平行說明NPAB仅作用于一个必需基团,再从二氫肉桂酸对这一抑制作用的?た蠢?这一基团可能是酶活性中心的一部分。NPAB对胰島素及核糖核酸酶的作用受pH影响,說明这一反应受蛋白分手中解离基团的控制,并且从它的pK值看来,这一解离基团很可能是组氨酸的咪唑基。pH影响木瓜蛋白酶和胰疑乳蛋白酶与NPAB的作用較为复杂,可能有不只一种解离基团参与控制它們与NPAB的反应。     

植物根构型特性与磷吸收效率

植物根构型,即根系在生长介质中的空间造型和分布,与磷吸收效率密切相关;认识植物根构型,可为植物磷效率的遗传改良提供依据。长期以来,人们试图定量描述植物根构型,确立一个能客观全面地描述根系三维立体构型的综合指标。试验指出,植物主要通过向地性变化和根冠之间的碳源分配来改变根构型,从而影响磷吸收效率;根系向地性变化可由缺磷等因素所诱导,且存在着一定的遗传变异性。有证据表明,根构型对低磷胁迫的适应性变化是     

核酸的酸变性研究 Ⅰ.牛肝大分子核糖核酸在加酸变性过程中的某些理化性质分析

(1)本文测定了牛肝大分子RNA在加酸变性过程中的一些物理化学性质的变化。(2)电位滴定显示牛肝大分子RNA在顺滴定至pH4以下时,表现有一定的滞后现象。顺逆滴定的差值此DNA小。滴定至不同终点时表现出不同程度的变性。(3)加酸变性过程中,RNA的还原粘度逐渐降低,到达pH2.6时还原粘度可降至正常RNA的20—30%。这一变化具有可逆性,但不能恢复至原来的还原粘度值。一般可达到未经变性RNA还原粘度的70—90%。(4)应用RNA在加热时还原粘度上升的性质,证明RNA在短时间内加酸变性并不破坏分子链的完整性。(5)RNA在加酸变性过程中紫外吸收光谱的改变,显示有较小的增色性,在260—300mμ之间光谱有明显向长波一方移动的现象。这些变化都具有可逆性。(6)根据上述结果,对RNA在加酸变性过程中分子可能发生的改变进行了讨论。     

胰蛋白酶处理对质膜Ｈ^＋—ATPase钒酸钠抑制效应的影响

采用经蔗糖密度梯度法纯化的大豆（Ｇlycine max L.)下胚轴质膜微囊为材料,分析了胰蛋白酶处理对质膜Ｈ^ -ATPase钒酸钠抑制效应的影响。实验结果显示,温和胰蛋白酶处理显提高Ｈ^ -ATPase的ＡＴＰ水解活力。并且发现酶切处理降低了钒酸钠对ATPase的抑制效应,当钒酸钠浓度为２mmol/L时,ATPase活力仅被抑制５３．４９％,而未经酶切的对照组则被抑制６４．１３％,ＡＴＰ水解动力学分析表明,胰蛋白酶酶切处理既不影响ＡＴＰ水解的Ｋm值也不影响钒酸钠的抑制类型,酶切前后的Ｋm值都等于０．３４mmol/L,并且都属于反竞争抑制。以上结果显示胰蛋白酶酶切处理可能改变了磷酸酶结构域的结构而影响了钒酸钠的抑制效应,暗示Ｃ－末端调节着磷酸酶结构域的结构和功能。     

铜锌超氧化物歧化酶的盐酸胍变性

采用发生在Ｆｅ（ｃｎ）＾４－６离子与铜锌超氧化物歧化酶活性部位的Ｃｕ＾２＋离子间的电荷传递反应敏感地检测到了胍变性引起的酶活性部位的微弱构象变化。胍变性样品的活力变化经离子强度修正而测得,紫外吸收,ＣＤ,内源荧光,和ＥＳＲ分析分别从不同角度反映了酶分子整体构象的变化情况。     

植物根构型特性与磷吸收效率

植物根构型，即根系在生长介质中的空间造型和分布，与磷吸收效率密切相关；认识植物根构型，可为植物磷效率的遗传改良提供依据。长期以来，人们试图定量描述植物根构型，确立一个能客观全面地描述根系三维立体构型的综合指标。试验指出，植物主要通过向地性变化和根冠之间的碳源分配来改变根构型, 从而影响磷吸收效率；根系向地性变化可由缺磷等因素所诱导，且存在着一定的遗传变异性。有证据表明，根构型对低磷胁迫的适应性变化是受基因调控的一个生理过程，其中乙烯可能是一种重要的生理调节物质。迄今已在一些植物上定位到了部分控制根构型的数量性状座位，为该性状的分子生物学改良提供了基础。随着现代技术的进展，植物根构型研究将取得更大的突破。