差减杂交方法的原理和应用

本文结合胡场盐诱导基因和盐抑基因的筛选，介绍了差减杂交技术的试验原理，设计思想和应用方法。     

金柑花蕾酵母双杂交cDNA文库构建及评价

为了探索金柑花发育的分子机制并研究与金柑花发育相关重要基因编码的蛋白质之间的相互作用,本研究以融安金柑不同生长时期的花蕾为材料,采用SMART技术构建了cDNA文库,对该文库进行了鉴定评价。经检测,所构建的cDNA文库滴度为2.83×10^8cfu/mL,文库库容为1.42×10^10cfu,重组率为97.91%,插入的双链cDNA片段长度主要分布在250~2 000 bp之间。结果表明,该文库达到了建库标准,理论上涵盖了全部与融安金柑花蕾发育相关的基因,为后续利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白提供了物质基础。     

3种杓兰属植物菌根真菌系统发育和多样性分析

兰科植物菌根真菌(Orchid mycorrhizal fungi, OrMF)在兰科植物种子萌发和后续生长发育过程中具有重要作用。该研究采用培养(菌丝团分离)和非培养(克隆文库)2种方法获得同一栖息地3种不同杓兰属植物根中菌根真菌ITS序列并划分可操作分类单元(Operational taxonomic units, OTUs),分析其系统发育关系和多样性。结果表明:(1)所有根段中都有菌丝团定植,共分离出菌根真菌64株,其中63株为胶膜菌科(Tulasnellaceae)真菌,1株为角担菌科(Ceratobasidiaceae)真菌;可划分为7个OUT,每个OTU代表菌株的菌丝都能形成OrMF典型的近球形或椭球形链状排列的念珠状细胞;分离出来的菌根真菌均为无性型菌丝且不产生无性孢子。(2) 非培养法得到的3种杓兰属植物的根中OrMF分别隶属于胶膜菌科(Tulasnellaceae),腊壳菌科(Sebacinaceae)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)和革菌科(Thelephoraceae),其中胶膜菌科OTU在种类和数量上占有绝对优势,培养和非培养2种方法得到的OrMF OTU类型和数量均为西藏杓兰(Cypripedium tibeticum)>无苞杓兰(C. flavum)>黄花杓兰(C. bardolphianum),但培养法少于非培养法。(3)对胶膜菌进行系统发育分析显示,优势和非优势OTU均分布在系统发育树的3个不同分支上,这种与多种亲缘关系较远的OrMF共生的现象可能与杓兰属植物对环境的适应性有关,且不同杓兰的OrMF物种丰富度没有显著差异,但群落结构存在差异。     

斯氏油脂酵母基因组Fosmid文库的构建及降解百草枯氮次级代谢相关基因的筛选

斯氏油脂酵母在以百草枯作为唯一氮源的培养基中能降解百草枯,但其机制尚不清楚。为分离鉴定斯氏油脂酵母中降解百草枯的相关基因,本研究通过构建斯氏油脂酵母的Fosmid文库,用百草枯作为筛选标记,成功筛选到7个百草枯抗性的大肠杆菌克隆。对阳性克隆插入片段进行了测序分析,并对真核基因进行注释。结果在插入片段中发现了nmrA基因及氮代谢相关基因,nmrA是真菌在限氮的条件下才激活的氮代谢相关基因,能调控激活下游的次级氮代谢基因家族,分解那些不常见的氮源。这提示斯氏油脂酵母可能也具有氮的次级代谢调控机制,在百草枯作为唯一氮源的环境下斯氏油脂酵母能激活次级氮代谢相关基因,分解代谢百草枯。     

高丛蓝莓类黄酮3′-羟化酶基因F3′H的克隆及表达特性分析

以高丛蓝莓(Highbush blueberry)"喜来(Sierra)"和"日出(Sunrise)"为研究材料,通过RACE(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术获得蓝莓(Vaccinium ssp.)F3′H基因的全长c DNA序列,并使用生物信息学工具对该基因编码蛋白的氨基酸组成及理化性质、二级和三级结构,以及氨基酸序列的相似性等进行了预测和分析。利用荧光定量PCR(RT-q PCR)手段来检测其在蓝莓果实不同发育时期表达情况。结果表明:Vs F3′H全长c DNA为1 871 bp,编码530个氨基酸,蛋白相对分子质量为58.33 k D,理论p I值为7.32;蛋白疏水性指数为0.004,属于疏水性蛋白,二三级结构预测可知其富含α-螺旋和无规则卷曲。RT-q PCR发现Vs F3′H主要在果实发育前期表达量较高,蓝果期表达量明显下调,且在不同品种中以蓝果期的表达量差异显著。这些研究结果为解析蓝莓果实色泽发育及果树分子育种奠定了理论基础。     

青岛市秋季空气微生物群落多样性

采用KC-6120空气综合采样器采集空气微生物样品,通过构建16S/18SrDNA克隆文库方法分析青岛市市区街道秋季空气微生物群落结构特征.结果表明： 空气细菌分布在6大类,分别为变形菌门(78.8%)、厚壁菌门(14.6%)、放线菌门(4.0%)、浮霉菌门(1.3%)、蓝藻门(0.7%)和栖热菌门(0.6%),优势菌属为不动杆菌属(39.7%)、葡萄球菌属(11.3%)、鞘脂单胞菌属(8.6%)和副球菌属(6.0%).空气真菌分布在子囊菌门(97.5%)和担子菌门(2.5%),优势菌属为核腔菌属(76.5%)、炭角菌属(13.6%)和外瓶霉属(2.5%).空气微生物中存在不动杆菌属、鞘脂单胞菌、葡萄球菌等致病菌或条件致病菌,以及引发多种农作物枯萎死亡的麦类核腔菌、团炭角菌和角状平脐疣孢等真菌.     

思茅松HDR基因全长cDNA克隆与序列分析

1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径中的最后一个酶,在植物萜类生物合成中起主控作用。该研究根据思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis)树皮转录组数据分析结果,首先获得了思茅松HDR基因片段,然后根据所获得的基因片段设计特异引物,提取受伤后的思茅松树皮的RNA,并运用RT-PCR和RACE技术从思茅松树皮中克隆得到完整的HDR基因(Pk HDR)。生物信息学分析表明:克隆获得的Pk HDR1基因c DNA全长序列为1 876 bp,含有1个1 464 bp的开放阅读框(ORF),编码487个氨基酸。同源性分析结果表明:思茅松HDR蛋白与赤松(Pinus densiflora)HDR蛋白的相似性高达99%。亚细胞定位及结构域分析结果表明:思茅松Pk HDR氨基酸序列中包含转运肽序列(A1-A61)及植物HDR蛋白多个保守的功能位点(A143,A234,A288,A371)。系统进化分析结果表明:Pk HDR蛋白与赤松HDR蛋白的亲缘关系最为接近。半定量PCR检测结果表明:树皮的创伤促进思茅松HDR基因的表达。该研究成功克隆获得HDR基因,并确定其与松脂代谢密切相关,为阐明思茅松松脂生物合成机制和分子育种提供了参考。     

高硫高砷金精矿生物预氧化条件优化

摘要:【目的】研究温度以及返回液添加量对体系中氧化效果以及金(Au)氰化浸出率的影响。【方法】针对某高硫高砷金精矿建立了一套连续生物预氧化体系(氧化时间6 d),比较不同的温度(40℃和45℃)和返回液添加量(0和600mL)对生物预氧化效果的影响:间隔8 h连续测定氧化体系中的氧化液、氧化渣以及氰化渣中的总Fe、总S、总As以及SO4 2－和Au含量;并用16S rRNA基因克隆文库的方法对体系中的浸矿菌群结构进行分析。【结果】结果显示,提高温度和添加氧化返回液都会改变体系:升高温度在一定程度上提高了体系的氧化程度,主要表现为显著降低了尾渣中总铁、总硫含量,显著提高了尾渣中的S6 + 比例,并且降低前三槽氧化体系的耗碱量;投加返回液则会降低体系的氧化程度,主要表现为显著提高了尾渣金品位和铁含量,显著降低了尾渣中的S6 + 以及Au 浸出率;Dissimilarity和DCA结果表明温度变化对体系的影响更为显著;氧化过程中的Au 浸出率、硫氧化率以及As 去除率,三者互为显著正相关;克隆文库结果显示,该浸矿菌群主要包括3类细菌: Acidithiocacillus caldu (71%)、Leptospirillum ferriphilum (23%)和Sulfobacillus thermosulfidooxidans(6%),基于97%相似性的OTU覆盖率达93.67%。【结论】研究结果表明,相对于添加返回液,温度变化会更显著的改变体系反应效率。提高体系温度有利于矿物的氧化,而添加返回液会降低Au浸出率。本文首次研究了连续生物预氧化过程中温度梯度和返回液添加对体系的影响,本研究结果对中温生物预氧化工业生产的工艺优化、降低工业运行成本具有重要的指导意义。