代谢工程在核黄素生产上的应用

核黄素(维生素B2)为天然水溶性的B族维生素,是维持机体代谢所必须的营养物质。目前核黄素的工业化生产主要有微生物发酵法和化学半合成法两种,其中微生物发酵法以生产工艺简单、原料廉价、环境友好以及资源可再生等优点而倍受世界核黄素生产商的青睐。代谢工程是近二十年来发展起来的新型学科,主要利用分子生物学技术对细胞进行遗传修饰,从而改进产物生成或细胞特性。为进一步提高核黄素产量,通过代谢工程手段构建出了核黄素高产菌株,其中尤以枯草芽孢杆菌最为成功。要得到较高的核黄素产率,必须保证碳架、能量等价物以及氧化还原辅(酶)因子在细胞代谢过程中处于适当的比率。以枯草芽孢杆菌进行核黄素生产为例,主要从增强碳源和能源利用效率、增强核黄素生物合成途径代谢流以及解除核黄素生物合成过程中的反馈调节方面综述了代谢工程在指导核黄素生产方面的应用,并讨论了其未来的发展方向。     

枯草芽孢杆菌ccpA基因敲除及对其核黄素产量的影响

CcpA蛋白是介导枯草芽孢杆菌碳分解代谢物阻遏(CCR)的全局调控因子,由ccpA基因编码。CCR效应的存在影响B.subtilis对葡萄糖的利用,降低B.subtilis生产发酵产品的效率。采用基因重组技术敲除了核黄素发酵菌株B.subtilis24/pMX45的ccpA基因,构建了CcpA缺陷株B.subtilis24A1/pMX45。发酵结果显示:B.subtilis24A1/pMX45能够在70h内基本耗尽10%的葡萄糖,生物量达到1.5×109个细胞/mL,溢流代谢产物积累量减少,在8%和10%葡萄糖浓度下,B.subtilis24A1/pMX45核黄素产量分别比B.subtilis24/pMX45提高了62%和95%。CcpA的缺陷,可以缓解葡萄糖引起的CCR效应,显著提高菌株的核黄素产量。     

化学沉降法回收核黄素母液

核黄素提取过程中,结晶液分离后会产生大量的母液。母液中包含一定量的核黄素,其中一部分是溶解状态的核黄素,另一部分是不溶解的微小晶体。分离过程中无法将这两部分核黄素收回,造成收率偏低。通过在母液中加入连二亚硫酸钠,将母液中可溶态和结晶态的核黄素进行沉降,沉降后进行精制分离,最终得到核黄素产品,可以提高核黄素提取的收率。     

硫胺素、核黄素和烟酰胺对大鼠体重增长及脂代谢影响的实验研究

目的：B族维生素以辅酶的形式参与糖、脂肪和蛋白质代谢,本文观察硫胺素、核黄素和烟酰胺补充对高脂饲料诱导大鼠肥胖的影响。方法：采用预防肥胖模型法,2×2×2析因设计分为8组：高脂对照组（F0组）,高脂＋硫胺素（F1组）,高脂＋核黄素（F2组）,高脂＋烟酰胺（F3组）,高脂＋硫胺素＋核黄素（F4组）,高脂＋硫胺素＋烟酰胺（F5组）,高脂＋核黄素＋烟酰胺（F6组）,高脂＋硫胺素＋核黄素＋烟酰胺（F7组）,每组12只大鼠,给予高脂饲料喂养,同时硫胺素（100mg／kgbw／d）、核黄素（100mg／kgbw／d）、烟酰胺（250mg／kgbw／d）灌胃,另设正常对照组（C组）12只,普通饲料喂养,自来水灌胃,15周后,分析其体重、摄食量、体脂重量、血脂等实验前后的变化情况及各组动物之间的差别。结果：经过15周喂养后,高脂喂养大鼠体重比正常对照组平均增加了15．7％;而补充烟酰胺（F3）及联合硫胺素（F5）或核黄素（F6）以及三者联合补充（F7）组高脂喂养大鼠与高脂对照组（F0）相比,体重分别降低了35．0％,30．0％,30．1％和30．6％（P值均小于0．05）;甚至比正常对照组大鼠平均体重分别下降了22．8％,17．0％,17．0％和17．7％（P值均小于0．05）;而补充核黄素或和硫胺素组大鼠体重没有明显增加或降低（P值均大于0．05）。血脂分析结果显示高脂喂养并联合补充核黄素或／和烟酰胺和／或硫胺素组大鼠血清CHOL和LDL水平明显低于高脂对照组;而高脂喂养并联合补充烟酰胺（F3）及联合硫胺素（F5）或核黄素（F6）以及三者联合补充（F7）组大鼠LDL／HDL比值分别0．29、0．26、0．25和0．26,明显低于F0组的0．37（P值均小于0．05）。结论：大剂量烟酰胺可有效地调节血脂水平和控制肥胖大鼠的体重增长,而核黄素及硫胺素对控制肥胖     

Eremothecium ashbyii T_(30)发酵产脂肪酶特性的研究

研究了一株核黄素高产突变株E .ashbyiiT3 0 产脂肪酶的条件 ,确定了比较合适的脂肪酶发酵培养基 :豆饼粉 30g/L ,玉米浆 30ml/L ,豆油 5ml/L ,KH2 PO4 5g/L ,MgSO4 ·7H2 O 0 15g/L ,pH消前7 5。T3 0 在此培养基上振荡培养 2 8h ,既定条件下测脂肪酶活力可达 2 32酶活单位 /ml(较原株提高 36 5 % ) ,从一个侧面证实其突变株特性。另外 ,对T3 0 所产脂肪酶的诱导酶属性及脂肪酶在T3 0 核黄素发酵过程中的作用也进行了初步探讨     

核黄素产生菌阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)抗反馈抑制突变株的选育

在调查阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)营养要求的基础上,设计了适合该菌生长的合成培养基,在合成培养基上诱变筛选得到了数株抗嘌呤拮抗物8-AG的突变株。选择其中三株U_(95-1)、U_(95-2)和U_(95-3)进行传代和摇瓶发酵试验,U_(95-3)的核黄素发酵单位低于出发菌,未经传代的U_(95-1)、U_(95-2)比出发菌株的发酵水平分别提高15.5％和9.8％,经5～10代传接,其产核黄素的遗传性状稳定。该研究表明,从代谢控制角度通过减轻核黄素合成途径中重要调节酶的反馈抑制对提高E. ashbyii的核黄素产量和稳定性是可行的,为该菌的菌种改良提供了一条遗传育种途径。     

啤酒抗日光嗅味的研究

啤酒中的３－甲基－２－丁烯－１－硫醇是由光照产生的。减少光照或减少其胶驱物质的产生是降低啤酒日光嗅味的有效途径。酵母和核黄素在ＭＢＴ的形成过程中起到关键作用同,还原酒花苦味物质能从根本上解决啤酒的日光嗅味。     

光敏反应对过氧化氢酶的影响

光氧化反应中,纯过氧化氢酶活性受光敏化剂血卟啉Ⅳ和核黄素的抑制。随光敏化剂浓度增高及照光时间延长,抑制程度加大。酶与光敏化剂反应后吸收光谱位移,峰形改变。紫外差示吸收光谱出现229nm负峰(血卟啉)和236—240nm峰(核黄素)。结果表明酶活的抑制与其蛋白构象的变化相关。     

小麦叶片β-1,3-葡聚糖酶的诱导、纯化与抗菌活性

三个小麦品种331、抗倒680和鲁麦23经氯化汞、水杨酸或核黄素处理后,叶片中的β-1,3-葡聚糖酶活性均有不同程度的升高.氯化汞处理24h对品种331该酶活性的诱导作用最强.因此取用氯化汞处理24 h的331小麦叶片研磨得到粗酶液.将粗酶液经硫酸铵分级沉淀、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephacryl S-100分子筛层析,得到了SDS-PAGE凝胶电泳谱带单一的β-1,3-葡聚糖酶样品.经SDS-PAGE(12%)和凝胶过滤层析,测得其分子量约为52.0～53.6 kD.抗菌试验测定显示,纯化的β-1,3-葡聚糖酶对供试的4种病原真菌的生长、孢子萌发或芽管伸长都有一定程度的抑制作用.