一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达

利用PCR技术扩增出pPIC9K载体的HIS4 Kan序列片段 ,与pPICZα重组 ,构建结合了两个载体特点的适合体外构建多拷贝基因表达盒的毕赤酵母表达载体pPICZα1,改造后的载体含HIS4 Kan序列 ,能整合到酵母染色体上 ,具有筛选方便、外源基因多拷贝组建迅速、蛋白产物分泌表达和易纯化等优点。将人脑源性神经营养因子(hBDNF)的cDNA(35 7bp)克隆入载体pPICZα1,利用同尾酶BglⅡ、BamHⅠ不可逆连接方式 ,分别构建含有 1、2、3、6个拷贝hBDNF表达盒的重组表达载体 ,电击法转化毕赤酵母GS115菌株 ,用G4 18和Zeocin筛选转化子 ,筛选到的阳性转化子用 0 5 %甲醇诱导 ,获得分泌型表达。表达产物类似于天然神经营养因子单体大小、分子量约 14kD。多拷贝hBDNF表达盒的表达水平亦高于单拷贝hBDNF表达盒 ,ELISA和Westernblot检测表明 :表达的蛋白能与鸡抗人脑源性神经营养因子抗体特异结合 ,证实该表达蛋白具有hBDNF的免疫原性     

原核生物16S rRNA基因多重拷贝及其序列异化

核糖体小亚基RNA(16S rRNA)分子存在于所有细胞生物中,在细胞中执行恒定的功能,其分子序列既有高度保守性片段,又有相对可变性部分,因而成为研究原核生物系统发育的理想分子,其基因已成为原核生物系统分类学研究的核心标识基因。但是,近年来的大量研究表明,原核生物基因组内16S rRNA基因是多拷贝的。16SrRNA基因拷贝数在种属水平上基本是稳定的,但在更高分类阶元上则是不确定的。在拷贝数多的菌株中各拷贝间还存在差异,这种差异有时会大于不同菌株间甚至不同种间的差异。原核生物基因组内16S rRNA基因拷贝数和异化与其利用环境资源的生态策略和对环境的适应性有关。原核生物16S rRNA基因拷贝数及其异化研究对深入理解原核生物的环境生态功能具有重要意义。     

GUS基因拷贝数对转基因在受体植物烟草中表达的影响

对农杆菌介导法获得的转 β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)烟草 (NicotianatabacumL .)进行GUS表达分析 ,发现部分转基因植株无GUS活性。进一步Southern杂交结果发现 ,GUS基因失活植株的基因组中整合了多个uidA拷贝 ,而GUS活性高的转基因植株多为uidA单拷贝整合 ,表明uidA基因失活与基因多拷贝整合有关。Northern杂交结果显示 ,失活植株无特异uidARNA杂交带 ,而GUS活性高的植株可检测到明显的杂交信号 ,说明多拷贝引起的基因失活发生在RNA水平。     

DNA序列在悬钩子属植物分子系统学研究中的应用进展

悬钩子属植物种类繁多,类群复杂,而且多为多倍体和杂种。该文就近年来国内外有关DNA序列在悬钩子属植物分子系统学研究中的应用现状和进展进行了综述,并对中国悬钩子属植物系统发育研究进行了展望。研究认为:叶绿体DNA序列多应用非编码区,且多与ITS序列联合分析;核基因组中ITS序列应用最为广泛,主要用于研究悬钩子属空心莓组与木莓组的进化关系、栽培品种间亲缘关系及部分杂种和多倍体的起源等;在该属植物中发现了ITS个体内多态性,但未进行ITS假基因检测,其系统学应用价值需重新评价;低拷贝核基因只有GBSSI和LEAFY有相关应用。同时认为,悬钩子属植物系统学研究中应用的DNA序列及研究类群均较少,缺乏对整个悬钩子属全面而系统的研究。指出应进一步选择具有代表性的样本、筛选合适的DNA片段,并结合形态学、孢粉学和细胞学等手段对中国悬钩子属植物系统关系进行深入研究。     

不稳定EGFP细胞模型的构建及其在基因编辑体系评价中的应用*

目的:为了更好地评价基因编辑效率,满足高通量筛选应用中快速、高效的检测要求,在细胞上建立一个原位检测方法具有重要的意义。通过检测荧光蛋白信号强度的变化可以评价CRISPR系统在细胞中的基因编辑情况,然而这一方法的效率受限于荧光蛋白较长的半衰期。方法:将鸟氨酸脱羧酶降解结构域(含PEST序列)与EGFP融合,通过慢病毒系统感染HEK-293T细胞,获得了表达单拷贝、EGFP-PEST报告基因的稳转细胞系。结果:与EGFP相比,EGFP-PEST在细胞内的降解速度明显加快,荧光水平在4 h内显著降低。利用该模型比较了3种商品化脂质体介导的CRISPR/Cas9基因编辑效率,能够在2~4 d实现定性和定量评价。结论:这一模型能够快速、灵敏地指示基因编辑效果,可以用于不同CRISPR系统或新递送工具的高通量筛选和评价。     

影响甲醇酵母中外源蛋白表达的因素

甲醇酵母系统由于其在表达蛋白方面无可比拟的优越性,已越来越得到广泛的应用。但不同的个源蛋白表达量有很大差异。介绍了影响甲醇酵母中外源蛋白表达的因素,这将有助于揭示甲醇酵母中外源蛋白表达的内在机制。     

星星草质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆和特性分析

用RT-PCR及RACE方法从盐生植物星星草中分离了Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因的cDNA（PtSOS1,GenBank登录号EF440291）,PtSOS1的cDNA长度为3775bp,5’非翻译区为69bp,3’非翻译区为292bp,开放阅读框为3414bp,编码1137个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,PtSOS1与小麦、水稻和拟南芥质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白的一致性分别为88％、79％和66％。预测分析表明,PtSOS1具有11个跨膜结构区域,基因组DNA的Southern分析表明PtSOS1是单拷贝基因。半定量RT-PCR结果显示,PtSOS1的mRNA受盐胁迫上调表达,暗示PtSOS1可能在星星草较强的抗盐碱能力中起作用。     

不吸水链霉菌梧州新亚种限制-修饰系统初探

采用菌丝体原位包埋方法和高压脉冲电泳技术从不吸水链霉菌梧州新亚种(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis neosubsp. 11371)中分离得到两条质粒DNA带.通过双向电泳证明,2个质粒均为线性分子,按照分子量大小依次命名为pSAL1、pSAL2.并对不吸水链霉菌梧州新亚种的限制-修饰系统进行初步探讨:将来自变铅青链霉菌TK54的高拷贝质粒pIJ702转化不吸水链霉菌梧州新亚种原生质体,未能得到转化子,改用pIJ702转化不吸水链霉菌梧州新亚种U-3原生质体,得到了转化子.