植物转基因沉默与消除

植物基因工程研究是希望获得高稳定表达的转基因植株,而转基因沉默现象却限制了转基因植物的应用前景。基因沉默的机制是多方面的,包括转基因多拷贝之间的异位配对,转基因序列的甲基化,插入位点在染色体结构上的改变及转录后的衰退调控等。研究外源基因的失活原因及寻找相应的策略控制失活,对于植物基因工程的发展有着重要的意义。     

玉米核基质结合区在烟草中对外源转基因表达水平的影响

为研究核基质结合区 (matrixattachmentregion ,MAR)在转基因植物中的功能 ,将来自玉米基因组的MAR序列构建在植物表达载体T_DNA中 ,并将报告基因β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)插入两段MARs序列之间。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体分别转化烟草 (NicotianatabacumL .)。GUS活性检测表明 ,MARs可以显著提高外源基因uidA在转基因烟草中的表达水平 ,平均表达水平提高 2倍 ,最高单株活性可达 10倍。并且转基因植株GUS活性高低与稳定mRNA的量成正比 ,表明MARs在转录水平提高基因表达。     

玉米核基质结合区在烟草中对外源转基因表达水平的影响

为研究核基质结合区(matrix attachment region, MAR)在转基因植物中的功能,将来自玉米基因组的MAR序列构建在植物表达载体T-DNA中, 并将报告基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(uidA)插入两段MARs序列之间.将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体分别转化烟草(Nicotiana tabacum L.).GUS活性检测表明,MARs可以显著提高外源基因uidA在转基因烟草中的表达水平,平均表达水平提高2倍,最高单株活性可达10倍.并且转基因植株GUS活性高低与稳定mRNA的量成正比,表明MARs在转录水平提高基因表达.     

植物转基因沉默与消除

植物基因工程研究是希望获得高稳定表达的转基因植株,而转基因沉默现象却限制了转基因植物的应用前景,基因沉默的机制是多方面的,包括转基因多拷贝之间的异位配对,转基因序列的甲基化,插入位点在染色体结构上的改变及转录后的衰退调控等,研究外源基因的失活原因及寻找相应的策略控制失活,对于植物基因工程的发展有着重要的意义。     

卤代烷烃脱卤酶基因在拟南芥中反式失活系统的建立

以细菌Xanthobacter autotrophicus卤代烷烃脱卤酶基因为遗传负选择标记,建立了该基因在拟南芥中反式失活的实验系统,在卤代[烷烃脱卤酶转基因的拟南芥中,有1株表现为转基因失活,离体核run-off转录实验表明为基因转录后沉默（这里特指沉默位点）,用这一转基因沉墨植株与同源转基因高效表达植株（这里特指同源转基因位点）杂交,结果96％的F1代植表现为同源基因反式失活,将F1代植株自交,使部分沉默位点与反式失活的同源转基因位点分离,结果200株子代中有42株表现DhlA活性,158株无DhlA活性,即 dhlA沉默植株与表达植株之比为3．76：1,表明沉默位点是以孟德尔显性因子方式使同源转基因位点反式失活的。     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达

以玉米(Zea mays L.)黄化苗为材料,利用PCR技术扩增了玉米19kDa醇溶贮藏蛋白基因(zein)起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的-1～-694片段具有19kDa zein启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达90％以上。将此启动子插入pPKGT的GUS基因及NOS终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草(Nicotiana tabaccum Var.samsum),得到了转化植株。转化的烟草的PCR扩增及Southern杂交证明目的片段已整合到烟草基因组中。转基因植株的GUS活性检测表明,在叶、根中无GUS活性,GUS活性只存在于种子中。转基因植株烟草种子经冷冻切片,GUS底物Xgluc活体组织染色证明GUS活性只存在一层介于种子胚乳与种皮之间的细胞中。     

核基质结合区在转基因烟草中对转基因表达的影响

为研究核基质结合区 (matrixattachmentregions,MARs)在转基因植物中对外源转基因 (transgene)表达的影响 ,将来源豌豆 (PisumsativumL .)的MARs序列构建在报告基因 β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)的两侧形成植物表达载体。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体经根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens(SmithetTownsend)Conn)介导转化烟草 (NicotianatabacumL .)。GUS活性检测表明 ,MARs可以提高外源uidA基因的表达水平。和不包含MARs的转化植株相比 ,MARs序列的存在可以使uidA基因的平均表达水平提高 2倍 ,最高的可达 5倍     

玉米Ubi-1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因-1启动子(Ubi-1)与大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因(gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自玉米未成熟胚盾片组织的I-型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织、细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达.UbiGUS在花粉、卵细胞和T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性.对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈11分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传.同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生.目前已得到第二代转基因种子.     

玉米Ubi－1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因－1启动子（Ubi-1)与大肠杆菌β－葡萄糖苷酸酶基因（gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自水成熟胚盾片组织的I－型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织,细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达。Ubi：GUS在花粉,卵细胞中T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性。对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈1：1分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传。同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生。目前已得到第二代转基因种子。     

转基因白桦中GUS 基因表达的定量分析

以转基因白桦(Betula platyphylla)为材料, 采用单酶切结合Southern杂交的方法揭示不同转基因植株中GUS基因的整合拷贝数为1-4个。采用组织化学染色法定性分析不同整合方式转基因白桦植株中GUS基因的表达。结果表明, 11个转基因植株中有2株出现了GUS基因沉默, 其余植株均有不同水平的GUS表达。在此基础上应用分光光度法定量分析不同拷贝数的GUS转基因白桦中b-葡萄糖醛酸酶活性。结果表明, 在11个转基因无性系中除2个株系的GUS基因沉默外, 其它9个转基因植株中GUS酶活力差异明显, 但这种差异与GUS基因的拷贝数没有必然联系。     

植物转基因的失活与沉默

植物外源基因转化研究揭示有相当比例的植物转基因表现失活与沉默。这一现象涉及转基因重复拷贝之间的异源配对,基因顺序的甲基化,转录后的衰退调控以及插入位点染色质高级结构的改变,并与外源基因的随机整合有关。克服转基因失活的方法包括单拷贝转基因子代筛选,构建细胞核基质支架附着区栽体以及采用具有特殊功能的启动子与增强子。转基因失活问题的发生提示人们．外源基因的转化与整合存在一些特有的遗传机制。     

核基质结构区在转基因烟草中对转基因表达的影响

为研究核基质结合区（matrix attachment regions,MARs）在转基因植物中对源转基因（transgene）表达的影响,将来源豌豆（Pisum sativum L.）的MARs序列构建在报告基因β－葡糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS）基因（uidA）的两侧形成植物表达载体。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体经根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend)Com）介导转化烟草（Nicotiana tabacum L.）。GUS活性检测表明,MARs可以提高外源uidA基因的表达水平,和不包含MARs的转化植株相比,MARs序列的存在可以使uidA基因的平均表达水平提高2倍高的可达5倍。     

转基因白桦中GUS基因表达的定量分析

以转基因白桦（Betula platyphylla）为材料,采用单酶切结合Southern杂交的方法揭示不同转基因植株中GUS基因的整合拷贝数为1—4个。采用组织化学染色法定性分析不同整合方式转基因白桦植株中GUS基因的表达。结果表明,11个转基因植株中有2株出现了GUS基因沉默,其余植株均有不同水平的GUS表达。在此基础上应用分光光度法定量分析不同拷贝数的GUS转基因白桦中β-葡萄糖醛酸酶活性。结果表明,在11个转基因尢性系中除2个株系的GUS基因沉默外,其它9个转基因植株中GUS酶活力差异明显,但这种差异与GUS基因的拷贝数没有必然联系。     

水稻谷蛋白GluA-2基因5′上游序列控制下的UidA基因在转基因水稻胚乳中的表达模式

为了研究谷蛋白胚乳特异性表达启动子在我国栽培稻品种中的表达模式,将UidA基因分别置于水稻谷蛋白GluA—2基因750bp和2．3kb上游序列下游,利用农杆菌转化法导人栽培稻品种中花8号并获得转基因植株。Southern blot检测表明,UidA基因已经整合到水稻基因组当中并以单拷贝存在。Northern blot检测表明,开花后13～15d和11～13d,UidA基因和水稻内源的GluA—2基因的表达量分别达到最高,随后逐渐降低。对转基因植株种子的GUS染色表明,UidA基因仅在胚乳中表达,在糊粉层中GUS表达量最高。测定了2．3kb和750bp转基因植株种子的GUS活性,结果表明前者的GUS活性是后者的2～3倍。序列分析表明,位于GluA—2基因转录启始位点上游2170bD的G-box可能是一个与表达量相关的顺式调控元件。     

利用根癌农杆菌法获得转基因水稻植株及其后代

在100μmol／L乙酰丁香酮（AS）等vir基因诱导分子存在的情况下,用含双元载体pBYT2的根癌农杆菌菌株EHA101同水稻（OrizasativaL．）台北309悬浮培养细胞共培养3天。经过2个月的连续筛选,共从364颗同根癌农杆菌共培养的悬浮培养细胞团中得到17个具有稳定潮霉素抗性和GUS表达的愈伤组织。对从8个转化组织中得到的10株可能的R0代转基因植株及其后代进行外源基因的整合和表达分析,Southern分析表明外源基因已稳定地整合进水稻基因组中并实现了有性遗传传递。杂交结果显示在其中一个转化系的植株中有5个拷贝的T－DNA整合,而其余的转化系则只整合了1个拷贝。转基因水稻细胞及植株中GUS活性的组织化学染色观察和荧光分析表明玉米ubiquitin基因启动子在水稻细胞中能高效启动gus报告基因的表达。ndPAGE－X－Gluc法检测表明转基因水稻细胞中表达的GUS蛋白比Sigma公司的标准GUS蛋白（SigmaCo．G0786）要小,而与来自大肠杆菌HB101（pBI1121）中的GUS蛋白大小相同。结果表明,根癌农杆菌可有效且可靠地介导外源基因转化水稻。     

利用Ac/Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记转基因植株的方法

获得无选择标记转基因植株是进行重复转基因及消除转基因植株中标记基因潜在危害性的关键。实验采用了Ac／Ds转座子系统在水稻(Oryza sativa,L．)中进行无hpt选择标记的转基因。将含有目的基因bar的Ds元件和hpt标记基因置于同一个T-DNA中,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHAl05介导将Ac-T-DNA及Ds-T-DNA分别转入到不同的水稻植株,再将单拷贝的Ac-T-DNA植株与单拷贝的Ds-T-DNA植株杂交得到同时含有Ac和Ds元件的F1植株,Fl自交产生F2后代,F2植株中转座后的Ds元件与T-DNA独立分离,在总共100株F2水稻植株中筛选得到2株只含有Ds元件插入而无hpt标记基因的转基因水稻植株。结果表明,利用Ac／Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记的转基因植株是可行的。     

Class I patatin基因5′侧翼区驱动的GUS基因在马铃薯块茎中专一性表达

将1.4kb Class I patatin基因的5′侧翼区与GUS基因融合,构建了双元表达载体pPATIs(含patatin部分信号顺序)和pPATI(不含patatin部分信号顺序)。pPATI通过基因枪介导在块茎切片中获得了瞬间表达。以上建构物通过农杆菌介导转入了马铃薯品种Desiree。X-Gluc染色(PATIs不能染色)及PCR结果证实已获得转基因植株。利用离体块茎诱导系统,GUS的表达进一步用荧光进行定量检测,结果显示,PATI-GUS的转基因植株中GUS比活性均以块茎明显高于茎段,达10-20倍。蔗糖浓度的升高,PATI-GUS植株中的GUS比活性无明显变化,与前人报道有不同。此外,光照促进PATI-GUS的表达。     

玉米脱氧麦根酸分泌通道蛋白基因YS3启动子的克隆与启动活性分析

缺铁是世界范围内农业生产面临的严重问题,玉米通过分泌脱氧麦根酸(2’-deoxymugineic acid, DMA)吸收利用土壤中的难溶性铁。为探明玉米DMA分泌通道蛋白基因YS3的表达和调控机制,本文通过克隆获得长为2813 bp的YS3基因启动子,该序列含有大量TATA-box、CAAT-box等启动子基本元件,以及光响应、激素调控等多个顺式调控元件;构建YS3启动子驱动GUS基因的植物表达重组载体pCAMBIA-YS3GUS,利用农杆菌介导转化拟南芥,获得pYS3::GUS转基因植株,对转基因植株进行GUS组织化学染色,并通过石蜡切片技术对转基因植株进行组织观察,分析pYS3::GUS转基因植株中YS3基因启动子的活性。结果表明,YS3启动子主要驱动GUS基因在拟南芥根部表达,且主要集中在根部表皮细胞,机械损伤可激发YS3启动子活性,驱动GUS基因在损伤临近部位表达。本研究对于理解玉米DMA分泌的分子调控机理方法od3 gmaigensuan有重要意义。     

Class I patatin基因5＇侧翼区驱动的GUS基因在马铃薯块茎中专一性表达

将1.4kbClassIpatatin基因的5＇侧翼区与GUS基因融合,构建了双元表达载体pPATIs(含patatin部分信号顺序)和pPATI(不含patatin部分信号顺序).pPATI通过基因枪介导在块茎切片中获得了瞬间表达.以上建构物通过农杆菌介导转入了马铃薯品种Desiree.X-Gluc染色(PATIs不能染色)及PCR结果证实已获得转基因植株.利用离体块茎诱导系统,GUS的表达进一步用荧光进行定量检测,结果显示,PATI-GUS的转基因植株中GUS比活性均以块茎明显高于茎段,达10-20倍.蔗糖浓度的升高,PATI-GUS植株中的GUS比活性无明显变化,与前人报道有不同.此外,光照促进PATI-GUS的表达.     

马铃薯遗传转化体系的优化及玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的导入

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系。通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株。经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达。