日本血吸虫期别差异表达基因文库的构建及分析

为从期别差异表达基因分析入手研究血吸虫的生长发育机制,应用抑制性消减杂交 (suppressed subtractive hybridization , SSH) 技术首次构建了日本血吸虫尾蚴、虫卵和成虫的期别差异表达基因文库 . 经消减效率分析和三种文库克隆的 EST 的期别差异性鉴定,表明所建文库质量较高,为在整个基因组水平分离血吸虫的差异表达基因提供了重要材料 . 由三个文库选择 257 个插入片段大于 500 bp 的克隆测定了 EST 序列 . 同源性分析结果表明 257 个 EST 代表 182 种血吸虫基因,其中有 22 种为血吸虫已知基因,有 128 种为血吸虫已知 EST ,有 32 种为新发现的血吸虫基因 . 对 EST 编码蛋白的功能预测结果显示：尾蚴消减文库的基因多与运动、能量代谢、转录调节及致病性相关;虫卵消减文库的基因可能参与信号转导、细胞粘附、蛋白质和碳水化合物的代谢以及抗氧化反应;成虫消减文库的基因多参与蛋白质的合成、转运及分解代谢,参与虫体的运动等 . 大规模分离、分析血吸虫期别差异表达基因将对从分子水平去解读血吸虫的生长发育机制,筛选高效疫苗候选抗原、药物靶标及诊断制剂有重要意义 .     

Isolation and Expression Pattern Analysis of Two Ferritin Genes in Tobacco

For understanding of the ferritin gene expression pattern and the mechanism of iron homeostasis in tobacco (Nicotiana tabaccum L.) plants, two full-length ferritin cDNAs, NtFerl and NtFer2, were isolated from tobacco seedlings and characterized. These cDNAs are 1 214 and 1 125 bp nucleotides and encode 251 and 259 amino acid residues, respectively. The deduced amino acid sequences showed that two tobacco ferritins share the same characteristics as the plant ferritins from Arabidopsis, soybean, and maize. Southern blotting analysis indicated that both NtFerl and NtFer2 were probably multicopy genes in the tobacco genome. Northern blotting analysis indicated that iron loading of tobacco plantlets increased the ferritin mRNA abundance and that NtFerl expression was higher and more sensitive to iron than NtFer2 expression. Furthermore, NtFerl was expressed in both leaves and roots, whereas NtFer2 was expressed mainly in leaves.     

云南文山铝土矿区微生物多样性初步研究

目的对云南文山铝土矿区矿石样品中的细菌多样性进行研究。方法采集云南文山铝土矿矿石样品,利用16SrRNA高变基因序列构建细菌基因文库,建立系统发育树,初步探究该矿区细菌多样性。结果文山铝土矿区矿石样品中细菌的主要菌群包括变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和梭杆菌门,其中优势菌群为变形菌门的细菌。结论云南省文山铝土矿区的矿石样品中存在丰富的细菌,且种群多样性较好。     

一种构建基因组文库的改进方法

构建基因组文库是一项非常基础和重要的工作。但利用传统方法构建基因组文库存在操作步骤繁琐、背景高等问题。为了解决这些问题,对传统构建文库的方法进行了改进。由于Ear I位点经酶切后突出3个可变碱基,经过设计可使酶切后的两个粘端无法匹配,从而防止载体环化,所以用两个Ear I位点作为克隆位点。基因片段是通过用Sau3AI部分酶切基因组总DNA,并在部分酶切片段的3`凹端补一个碱基G获得,因此片段无法串连或环化。本实验构建了基于上述改进的ARS探针载体pHBM803/Trp,并分别用改进方法和传统方法构建水稻基因组文库进行比较。实验结果表明,经过上述两点改进可使文库质量大大提高。     

用富集文库克隆人胰岛素基因组基因

通过构建可富集人胰岛素基因的λ噬菌体文库,克隆了人胰岛素基因组基因．首先从中国人血液白细胞中提取到人基因组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲⅠ和ＢｇｌⅡ对基因组ＤＮＡ进行全酶切,经０．４％琼脂糖凝胶电泳,特异回收９．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段．将该片段与λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨⅠ臂连接,构建成一个特殊的人基因组λ噬菌体文库（富集文库）,效价为２×１０４．同时采用ＰＣＲ方法及用引物Ⅰ：５′ＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧ３′,引物Ⅱ：５′ＣＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣ３′,从人基因组ＤＮＡ中扩增出一段含胰岛素基因的１．３６ｋｂＤＮＡ片段,做为放射性标记探针,对文库进行了噬菌斑原位杂交筛选,从１×１０４个噬菌斑中筛选到一个含人胰岛素基因组基因的阳性克隆,并进一步完成了亚克隆和该基因１７３２ｂｐＤＮＡ序列的测定．结果该基因的１７３２ｂｐＤＮＡ序列包括部分５′端和３′端与国外发表的人胰岛素α型等位基因的序列相同     

藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和基因文库的构建北大核心CSCD

【目的】建立藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的遗传操作系统和基因文库,以便筛选次级代谢产物生物合成基因。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌的属间接合转移的方法,以整合型载体pPM927、pSET152和复制型载体pJTU1278构建链霉菌遗传操作系统。以pCClFOS^(TM)载体,大肠杆菌EP1300^(TM)-T1~R为宿主菌构建Fosmid文库。随后,设计引物,利用"板池-行池-单克隆"的三级PCR方法对文库进行快速筛选。【结果】pPM927、pSET152和pJTU1278均成功转入藤黄生孢链霉菌NRRL 2401,其中pSET152载体的转化效率最高。构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的基因文库,含2880个克隆,平均插入片段大小约为35 kb,空载率小于1%,文库覆盖率为99.99%,覆盖基因组16.5倍。同时,初步筛选出可能含有吲哚霉素生物合成基因簇的9个阳性克隆。【结论】成功构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和高质量的基因文库,为克隆该菌中次级代谢产物生物合成基因簇以及进一步遗传改造奠定了基础。     

粪产碱菌(Alcaligenes faecalix)基因文库的构建和nifH基因同源顺序的克隆

采用λ噬菌体置换型载体EMBL4,构建了Alcaligenes faecalis A-15 H1菌株总DNA的基因文库。用Sau3AⅠ限制酶完成部分酶切,取13—20kb大小的片段进行克隆。载体DNA经BamHⅠ和SaiⅠ完全双酶切,左右臂“退火”形成左右臂载体分子后再与外源片段连接。左右臂载体分子与外源片段按照1:1的分子比进行体外连接。用E.coli BHB2688和E.coli BHB2690制备的包装抽提物进行体外包装,所得基因文库效价测定为1.2×10~6 pfu,远远超过理论上所需的库容量。以nif H基因作为探针,经3轮噬菌斑原位杂交,从基因文库中筛选出含有其同源顺序的克隆,并得到了梯度点杂交的验证。对所得重组噬菌体克隆之一进行Southern转移杂交,结果证实,其3.5kb的EcoRⅠ酶切片段为nif H阳性杂交条带。将其克隆到质粒pUC19 DNA上后,转入受体菌JM101中。再次经Southern转移杂交,证明所得重组质粒克隆(pAFH)含有粪产碱菌中的与nifH基因有同源顺序的片段。     

银合欢基因文库的构建和种子贮藏蛋白基因的分离

本文以λEMBL_3为载体,构建了银合欢(Leucaena leucocephala)的基因文库,所得重组子为3.5×10~6pfu。以大豆种子贮藏蛋白α′亚基基因为探针,从基因文库中分离得到了4个阳性克隆,并初步绘制了其中3个重组子的物理图谱。结果表明在这3个重组子的基因内部有一致的酶切位点。亚克隆的部分核苷酸序列与 GenBank 中的基因序列比较,表明与大豆种子贮藏蛋白α′亚基基因高度同源。     

野生大豆基因文库的构建

以氯化铯密度梯度离心法纯化噬菌体λEMBL4,将纯化的EMBL4 DNA用BamH1/SalI双酶切制成载体。用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取野生大豆(种名待定)大分子DNA,Sau3A部分酶解,从琼脂糖凝胶中回收10—22kb“目的”DNA片段,与载体连接,体外包装成重组噬菌体。所得重组子值为8×10(?)pfu(噬菌斑形成单位),达到了构建野生大豆基因文库要求的理论值。以栽培大豆7S贮藏蛋白a′-cDNA作探针,用噬菌斑原位杂交法从文库中筛选出一个阳性克隆。