《中国药典》中标准菌种质控新方法的研究

目的 研究《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)纳入的标准菌种质控新方法,并评价不同批号标准菌种的质量稳定性。方法 对脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行比较研究,同时整合16SrRNA基因序列分析、多位点序列分型和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等质控新方法,进行标准菌种质控新方法的建立,并对标准菌种的质量进行评价。结果 形成了适用于《中国药典》中标准菌种的方法,并通过整合的质控新方法对不同批号的标准菌种进行评价,结果显示,菌种质量稳定,遗传信息无改变。同时,建立了标准菌种16SrRNA基因标准序列、PFGE标准指纹图谱和标准基因型。结论 标准菌种质控新方法的研究,为更加全面、深入地评价标准菌种的质量提供了依据;建立的标准菌种质量控制体系及标准菌种质控鉴定信息,为标准菌种持续的质量控制奠定了重要的参比信息基础。     

乡村沼气池污泥微生物多样性的研究

为了优化沼气池产气效率和开展污泥微生物多样性研究,通过对PCR-DGGE条件的优化,建立了农村户用沼气池污泥微生物16S r DNA V3区DGGE分析技术,通过DGGE技术分析了沼气池污泥中细菌和古细菌微生物多样性随沼气池深度的变化规律。同时通过构建污泥样品mcr A功能基因克隆文库,应用RFLP技术,开展了农村户用沼气池污泥样品中与次级代谢产物相关基因的功能基因多样性研究。结果显示,农村户用沼气池污泥中含有丰富的微生物资源,其中细菌群落受污泥深度因素影响小,而浅层污泥中古细菌群落与深层污泥中古菌群落却存在明显差异。所采集的沼气池污泥中含有较为丰富的产甲烷菌资源,其中可能存在类似功能或产生类似代谢物质的产甲烷菌。该结果为进一步优化群落结构、筛选功能基因提供了科学依据。     

橘小实蝇成虫肠道可培养细菌群落结构分析

【目的】研究橘小实蝇(Bactrocera dorsalis) 3个种群(实验室正常喂养种群、实验室无菌糖水喂养种群和野生种群)成虫肠道可培养细菌的群落结构组成。【方法】利用16S rRNA基因的聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析技术,结合菌落形态观察和生理生化特征鉴定细菌种类。【结果】从橘小实蝇3个种群成虫肠道600株可培养细菌得到53种不同细菌遗传型,分属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)和芽孢杆菌科(Bacillaceae)等3个科。其中肠杆菌科是肠道可培养细菌最优势的细菌种类。同样以序列相似性大于97%的菌株归为相同的细菌种类为标准,找到了橘小实蝇3个种群可培养细菌的共有菌种,结合菌落形态观察和生理生化特征鉴定,确定共有菌种为肠杆菌属5株,克雷伯氏菌属2株,柠檬酸杆菌属1株,泛菌属1株,肠球菌属2株,以及芽孢杆菌属4株。【结论】通过研究橘小实蝇成虫肠道可培养细菌群落结构组成,可为探讨肠道菌群对寄主的生理功能和生态学意义奠定基础,最终为利用微生物防治此类害虫提供新思路。     

仔猪结肠中产甲烷菌群多样性及其与环境因子的相关性

【目的】为评价仔猪结肠中产甲烷菌群多样性及其与环境因子(日粮类型、断奶应激及日龄)的相关性。【方法】分别采集了7、14、21、24和35日龄仔猪结肠内容物,进行基因组总DNA的提取,运用变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术分析各结肠样总DNA的产甲烷菌的PCR产物,同时研究了与甲烷生成相关的结肠内挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid,VFA)的变化情况。【结果】结果表明,仔猪结肠内容物中乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸(Total volatile fatty acid,TVFA)浓度随日龄增加而显著升高(P<0.05),但丁酸浓度未有显著性变化(P>0.05);基于Dice模式的UPGMA聚类分析的DGGE指纹图谱结果显示,7-24日龄结肠样的产甲烷菌群落结构相似性较高,聚集到一个分支上;而35日龄的结肠样聚集到另一分支上;冗余分析(Redundancy analysis,RDA)结果表明,日龄和日粮类型与产甲烷菌群落结构的关联度较高;序列分析表明,仔猪结肠食糜中甲烷菌群主要以甲烷短杆菌为主,同时存在另一类未知甲烷菌。【结论】本研究表明,甲烷短杆菌是仔猪结肠中的优势产甲烷菌,日龄和日粮类型与仔猪结肠中产甲烷菌群落结构的相关性最强。     

利用PCR-DGGE方法分析不同鸡群的盲肠微生物菌群结构变化

研究不同品种、饲养阶段的健康和不良鸡群对盲肠细菌种群结构和多样性的影响。使用基于16S rDNA的PCR-DGGE技术,结合割胶回收DNA进行克隆和测序,分别以4、6、10、16、20、40周龄蛋鸡及1、2、4、6、7、8周龄肉鸡健康、不良鸡群盲肠内容物为样本,研究其中特定细菌类群的16S rDNA序列片段指纹图谱,并进行聚类分析,鉴定特异性和共性种群。在两品种健康鸡群盲肠内容物的细菌群落中,Lactobacillus属菌株的相似性均高于不良鸡群,并且在不同饲养阶段的健康、不良鸡群间指纹图谱平均条带数差异显著(P<0.05);而Bacteroides属菌株在健康鸡群盲肠内容物细菌的相似性与不良鸡群较为相近,健康、不良鸡群间平均条带数差异显著(P<0.05);Clostridium属菌株在蛋鸡20、40周龄的平均条带数差异不显著(P>0.05),但肉鸡各周龄健康、不良鸡群间的平均条带数差异显著(P<0.05)。序列测序结果,在蛋鸡产蛋期健康、不良鸡群样本中均检测到能动乳杆菌(Lactobacillus agilis),而育雏和育成期中均检测到鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)和不可培养细菌;两品种的健康、不良鸡群样本中均检测到Bacteroides属的生酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)、不可培养物细菌(Uncultured bacterium);而健康、不良蛋鸡群样本中均检测到Clostridium属不可培养的变形菌(Uncultured proteobacterium),健康肉鸡群中检测到索氏志贺菌(Shigella sonnei),而两品种不良鸡群中均缺乏此类菌种。结果显示,不同品种、饲养阶段的鸡群,其盲肠细菌群落的组成差异显著,并且细菌种群结构对鸡群的生长发育影响较大。     

Viili中益生菌的分离及其发酵性质研究

目的 利用传统方法和分子生物学方法从viili中筛菌并对其特性进行研究.方法 采用MRS、YPD和脱脂乳营养琼脂3种平板从viili中分离出15株单菌,利用V3区通用引物和乳杆菌特异性引物对各单菌的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)分析,将其归为5种不同菌.结果 16S DNA测序表明,5种单菌分别为Lactobacillus plantarum、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus paracasei、Bacillus cereus和Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.混合发酵实验表明:从viili中筛出的5种菌除Bacillus cereus外均有凝乳现象,其中Lactobacillus delbrueckii凝乳能力强,可在5 h内凝乳;Lactobacillus paracasei、Bacillus cereus和Lactobacillus plantarum组合产生的EPS量最多,高达186.71 mg/L,而Streptococcus thermophilus EPS产量仅为33.56 mg/L.结论 传统方法与分子生物学方法DGGE相结合,可以快速准确判断细菌种类;筛选菌特性研究结果表明,细菌之间的相互作用导致凝乳时间和EPS产量发生变化,其复合作用有待于进一步研究.     

蛋白质组学技术在植物类囊体膜蛋白研究中的应用

类囊体作为植物光合作用光反应的重要场所,在植物亚细胞蛋白质组学研究中倍受关注.介绍了植物蛋白质组学相关技术,包括双向凝胶电泳(2DE)、高效液相色谱(HPLC)、高效毛细管电泳(HPCE)、质谱(MS)和蛋白质组学数据库在植物类囊体膜蛋白研究中的应用.同时对类囊体膜蛋白质组学的研究趋势进行了探讨.     

影响琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的因素

在不同的电压与载样量下,分别使用溴化乙锭（EB）与新型核酸染料GoldViewna II及GoldView对凝胶中的DNA进行染色,观察电泳条带扭曲程度,了解电压、载样量与核酸染料对琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的影响.使用GoldViewna II染色,当电压≥10V/cm时,DNA条带的扭曲程度随载样量增大而加剧;当DNA载样量≥10ng时,DNA条带的扭曲程度随电压升高而加剧. 使用EB染色,仅当载样量≥50ng时,条带出现轻微扭曲,扭曲程度与电压无明显关系.结果表明使用GoldView染色,当电压不超过20V/cm或载样量不超过100ng时,DNA条带不扭曲.在琼脂糖凝胶电泳中,若要避免DNA条带扭曲干扰实验结果,使用GoldViewna II染色,若DNA载样量≥10ng,应控制电压≤5V/cm;使用EB染色,载样量应≤50ng;使用GoldView染色,可以使用20V/cm的电压缩短实验时间.     

凝胶电泳微流控芯片提取外泌体及对人血浆外泌体中miRNA-21的测定

为了开发一种用于人体血浆中外泌体的高效快速提取和分离的新型微流控芯片,文中收集健康人体外周血液样本,自主设计并制备基于纳米多孔薄膜和琼脂糖凝胶电泳的微流芯片。提取的外泌体使用透射电镜、Nanosight和Western blotting等技术进行表征,鉴定并分析其形态、浓度和粒径分布。同时将超速离心法和微流芯片所提取的外泌体进行粒径和浓度的分析比较,探讨两种方法各自的提取效率。最后,利用RT-PCR技术分析外泌体中miRNA-21的相对表达量。凝胶电泳微流芯片可在1 h内快速的从血浆中高效率地提取出纯度高、大小完整、尺寸分布在30–200 nm之间的外泌体,满足后续下游分析的要求。通过与现有最普遍的超速离心法进行对比分析,当血浆样本量小于100μL时,凝胶电泳微流芯片提取外泌体的效率为超速离心法的3.80倍。凝胶电泳微流芯片提取外泌体的优化参数是:电场电压:100 V;琼脂糖凝胶浓度:1.0%;注射泵流速:0.1 mL/h。凝胶电泳微流芯片可快速高效地提取出外泌体,对外泌体与癌症生物标记物的相关研究具有潜在的巨大优势,也为基于外泌体的即时诊断技术提供了可能。