Recent progresses in gene delivery-based bone tissue engineering

Gene therapy has converged with bone engineering over the past decade, by which a variety of therapeutic genes have been delivered to stimulate bone repair. These genes can be administered via in vivo or ex vivo approach using either viral or nonviral vectors. This article reviews the fundamental aspects and recent progresses in the gene therapy-based bone engineering, with emphasis on the new genes, viral vectors and gene delivery approaches.     

缺失宿主Vta1蛋白的MIT结构域对杆状病毒AcMNPV复制的影响

【目的】克隆草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Vta1基因,检测Vta1在苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)复制中的作用。【方法】利用反转录-PCR与PCR方法筛选草地贪夜蛾Vta1基因及缺失Vta1N-端MIT结构域的突变体并构建其瞬时表达质粒,通过转染Sf9细胞检测表达;构建Vta1及其突变体的双分子荧光互补表达质粒,并通过瞬时转染检测其与Vps4及ESCRT-III亚基Vps46与Vps60的相互作用;共转染gp64与Vta1及其突变体瞬时表达质粒,检测瞬时表达Vta1突变体对AcMNPV出芽型病毒产量及病毒基因启动子指导报告基因表达的影响。【结果】获得了草地贪夜蛾Vta1基因。氨基酸序列相似性分析表明,昆虫、酵母与人类Vta1同源蛋白的相似性分别约为20%与50%。Western blotting分析表明GFP标签的Vta1及其突变体均能在瞬时转染的Sf9细胞中表达。双分子荧光互补分析发现,缺失第1个或第2个MIT结构域显著降低Vta1突变体与Vps4、Vps46或Vps60的相互作用。此外,瞬时表达Vta1突变体显著降低了AcMNPV感染性出芽型病毒的产量,但并未影响AcMNPVie1基因早期启动子和p6.9基因晚期启动子指导的LacZ和GUS报告基因的表达。【结论】Vta1可能参与杆状病毒AcMNPV子代病毒粒子的组装和/或出芽释放过程。     

杆状病毒介导的基因传递逃避补体攻击的措施

血清补体系统是杆状病毒介导基因传递过程中的主要抑制因素.概述逃避补体攻击的有效措施:选择免疫赦免组织作为杆状病毒介导基因传递的靶标,例如眼睛、脑和睾丸;体外转导也能有效地逃避补体的攻击;利用补体的药理抑制剂或者对杆状病毒载体进行加工修饰,例如聚合物包被、假型化和展示补体抑制剂等,可以消除杆状病毒对补体的敏感性.有效地逃避补体攻击有助于杆状病毒广泛应用于基因治疗.     

AcMNPV肌动蛋白核定位基因的亚细胞定位

当前细胞核内肌动蛋白的功能是一个研究热点,核内存在肌动蛋白并参与细胞核内发生的许多生命活动。杆状病毒是迄今唯一报道的利用核内肌动蛋白进行复制增殖的病原微生物,为核内肌动蛋白的结构与功能的研究提供了独特的系统。有报道显示AcMNPV的ie-1,pe38,ac4,he65,ac102和ac152基因与肌动蛋白单体的核转运有关,然而关于这六个基因的亚细胞定位及其在肌动蛋白入核过程中的功能并没有深入的研究。本文首次揭示了这六个基因的亚细胞定位,IE1和AC152是全细胞分布,PE38和AC102也为核质分布,但主要分布在细胞核中,而AC4和HE65定位于细胞质。但AC102和IE1可以分别介导AC4和HE65入核。同时我们发现当使用外源强启动子OpIE2,在转染ie-1或pe38之后表达ac4和he65可以部分招募肌动蛋白单体入核,而时序性共转染这四个基因则可招募最多肌动蛋白单体入核。对肌动蛋白核定位基因在细胞中的定位分析为进一步了解杆状病毒介导肌动蛋白入核的分子机理提供支持。     

苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒AcMNPVP78／83蛋白初步研究

AcMNPV ORb-9编码病毒核衣壳蛋白P78／83,该蛋白在宿主细胞内以磷酸化和去磷酸化两种形式存在,能够与细胞骨架成分肌动蛋白相互作用,序列分析表明其具有与WASP蛋白类似的结构,推测可能在病毒粒子的包装、运输等过程中起重要作用。本文利用Bac—to-Bac系统构建了P78／83与绿色荧光蛋白融合表达的重组AcMNPV,激光共聚焦显微镜观察表明,重组病毒感染Sf21细胞12h后绿色荧光主要集中分布于细胞质中,24h及以后绿色荧光主要集中分布于细胞核中。感染试验表明,超表达P78／83对病毒的生长无明显的影响。     

AcMNPVie—1基因诱导的斜纹夜蛾细胞凋亡

苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)感染可诱导斜纹夜蛾 (Spodopteralitura)离体细胞Sl zsu 1发生典型的细胞凋亡。通过细胞松弛素 (cytochalasinD)和NH4Cl的抑制实验 ,分别排除病毒粒子结合细胞受体蛋白 ,和病毒在核内体运输过程启动细胞凋亡信号发生的可能性。RT PCR实验证实 ,病毒基因组进入了细胞核 ,极早期基因ie 1开始了转录 ;而DNA聚合酶抑制剂 (芽栖菌素 )的存在对病毒诱导的细胞凋亡程度与进程均没有明显的影响。这说明细胞凋亡的信号是先于病毒晚期复制事件启动的。单独转染AcMNPV极早期基因ie 1可诱导斜纹夜蛾离体细胞系Sl zsu 1细胞发生部分凋亡 ,转染 2 4h后出现凋亡小体 ,4 8h达到高峰。提取转染细胞的总DNA电泳 ,可检测到典型的DNA梯形条带 (DNAladder)。另外 ,AcMNPV的ie 1基因温度敏感突变株tsB82 1在非受纳温度感染细胞时 ,细胞不发生凋亡。这些结果暗示 ,在AcMNPV感染诱导的Sl zsu 1细胞凋亡中 ,ie 1基因是一个凋亡信号的直接或间接诱导因子。     

Baculovirus Actin-Based Motility Drives Nuclear Envelope Disruption and Nuclear Egress

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粉纹夜蛾细胞系QB—Tn9-4s的克隆以及克隆株生物学特性的研究

对粉纹夜蛾Trichoplusia ni细胞系QB-Tn9-4s进行细胞克隆,获得了8个细胞克降株,分别命名为QB-Tn-A、B、C、D、E、F、G和H.对基因组DNA进行RAPD-PCR鉴定,各细胞克隆株与原始细胞系具有相同的DNA扩增谱带.各细胞克隆株在形态和生物学特性方面表现出一定的差异.克隆株QB-Tn-A、B、c、D和E以梭形细胞为主,大约占细胞总数的60%～80%;F、G和H以棒状细胞为主,比例分别为44.5%、49.5%和80.O%.8个克隆株对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)均较敏感,感染率均在92%以上,平均每个细胞病毒多角体(OBs)产量在78～110个之间,其中克隆株QB-Tn-A多角体产量最高达110个,略高于BTI-Tn5Bl-4和QB-Tn9-4s,明显高于Sf-9细胞;克隆株QB-Tn-E、H、A和C的fIJ芽性病毒(BV)产量与原始细胞系(3.37×107TCID50/mL)接近,而其它4株均低于原始细胞系.