珍爱生命、关注社会、抗击禽流感--7年级生物学课堂实录

2004年初，我国及周边一些国家和地区先后发生禽流感(H5N1)疫情，个别国家还发生了从禽到人的疫情，并且有可能发生从人到人的传播。一时间，禽流感成了公众关注的焦点，在国务院号召全民防治禽流感的时刻，生物学教师更应该积极响应，在生物学教学中落实STS教育，加强禽流感知识的普及，培养学     

2017–2019年我国南方地区高致病性H5N6亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析

【背景】自2014年以来,H5N6禽流感病毒在我国家禽和活禽市场持续进化,成为人类和动物健康的重大威胁。【目的】对2017-2019年中国南方地区93株高致病性H5N6禽流感病毒的HA基因进行分子进化分析。【方法】接种9-11日龄鸡胚分离核酸检测阳性的H5N6标本,运用下一代测序平台对病毒分离物进行全基因组测序,从NCBI和GISAID数据库下载参考序列,利用BLAST、MEGA6.1及Clustal X等软件进行序列分析。【结果】2017-2019年,从189份江苏省H5亚型禽类/环境标本和1名H5N6患者咽拭子标本中共分离到43株病毒,完成了33株H5N6病毒的全基因组测序。下载网上同时期中国其他地区流行的H5N6毒株序列,对总计93株H5N6病毒的HA基因进行分子进化分析。93株H5N6病毒中有78株属于Clade 2.3.4.4h,9株病毒属于Clade 2.3.4.4e,4株H5N6病毒属于Clade 2.3.4.4b,1株属于Clade 2.3.4.4f,1株属于Clade 2.3.4.4g。所有93株病毒HA蛋白的裂解位点含有多个碱性氨基酸,表明它们都属于高致病性禽流感病毒。所有93株病毒HA蛋白的Q222和G224位氨基酸没有发生突变,保留了禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)结合特性;158位点丧失糖基化,同时124位出现一个新的潜在糖基化位点。【结论】2017-2019年间中国南方地区H5N6病毒进化活跃,具有明显的基因多样性,需要加强对病毒分子进化的监测。     

禽流感病毒样颗粒研究进展

病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是指由病毒一个或几个结构蛋白自行组装成不含病毒基因组且不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒。VLPs因能够模拟天然病毒的构象表位而保持了完整病毒颗粒所具有的免疫原性,可诱导机体产生广泛强大的抗病毒免疫反应,阻止病毒侵入机体,在抗病毒性疾病的预防或治疗性疫苗及诊断试剂的研究开发方面具有巨大的应用前景。本文就禽流感病毒样颗粒相关研究进展进行综述,以期为我国禽流感VLPs的研究提供参考。     

H5N1亚型禽流感病毒HA糖基化位点缺失突变株的构建及生物学特性

不同H5亚型禽流感(AIV)HA上糖基化位点的分布是不同的,然而不同糖基化位点对病毒的作用仍不十分清楚。本研究利用定点突变和反向遗传操作构建了3个不同糖基化位点单缺失突变病毒,并对其增殖特性和毒力进行了测定。结果表明,通过HA基因序列测定和免疫印迹分析证实已成功去除了特定糖基化位点。158位糖基化位点缺失突变株rS△158在鸡胚中的EID50和MDCK细胞上TCID50比野生型rS略低,空斑直径显著减小;而单独去除169位和290位糖基化位点的rS△169和rS△290的EID50和TCID50略高于野生型rS,空斑直径相近,但空斑数要比后者高出10倍以上。所有突变株及野生型病毒在CEF上增殖速率相同,对SPF鸡均是高致病性的。因此,糖基化位点可影响病毒的体外增殖,但结果因细胞而异。     

我国人感染禽流感病毒现状综述

禽流感病毒是一种主要在禽类之间传播的致病性病毒,但近年来屡有人感染禽流感的病例出现,给人类的生命带来了威胁,造成不可忽视的经济损失。而如今在我国又出现了人感染H7N9型禽流感病毒的疫情,针对这种现状本文简要对禽流感病毒以及现行的H7N9型禽流感病毒进行了综述。     

2013-2014年湖北省外环境中禽流感病毒污染情况分析

为了解2013-2014年湖北省外环境中禽流感病毒污染情况,采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对全省7个监测点1 642份活禽相关外环境标本进行禽流感病毒型别与阳性率监测.结果显示,2013-2014年湖北省外环境中禽流感病毒平均阳性检出率为19.1％,检出的禽流感病毒型别以H9亚型为主(占57.3％),未检出H7亚型.不同地区和季节禽流感病毒阳性率有所差异,鄂西北冬春季病毒检出阳性率高于鄂西南和江汉平原;家禽屠宰加工厂检出阳性率最高;阳性率最高的标本来自清洗禽类的污水.结果提示,湖北地区外环境中禽流感病毒阳性率较高,且型别多样,家禽屠宰加工人员对禽流感病毒有较高的暴露风险,需加强健康宣教,提高个人防护意识.     

通用型H5亚型禽流感病毒亚单位疫苗抗原表达和免疫效力研究

H5亚型高致病性禽流感病毒因其变异快、感染性和致病性强等特点严重威胁着家禽业和人类健康。为研制具有广谱保护性的H5亚型禽流感病毒通用型亚单位疫苗,本研究分析和对比各分支H5亚型禽流感病毒的HA蛋白基因,获得HA蛋白基因共有序列,采用杆状病毒表达系统构建和表达重组HA蛋白。经IFA、Western Blot、微量血凝试验等方法鉴定重组HA蛋白,结果显示重组HA蛋白在昆虫细胞中得到正确表达,血凝效价达13log2,且与禽流感Re6、Re7和Re8阳性血清均具有较好的交叉反应活性。免疫效力试验结果显示,重组HA蛋白疫苗组血清抗体能与H5亚型禽流感病毒Re6、Re7和Re8检测抗原反应,且能诱导机体产生较高水平IFN-γ和IL-4。该研究结果可为H5亚型禽流感通用型亚单位疫苗研发提供试验基础和科学依据。     

H5N1禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及生物活性鉴定

经RT-PCR扩增了H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)片断,限制性内切酶酶切后将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组转座载体pFastBac-H5。将pFastBacH5转化含有杆状病毒穿梭载体（bacmid）的DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-H5。rBacmid-H5在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,SDS－PAGE蛋白电泳、Western blot、血凝试验和血凝抑制试验分析表明：分子量约63Kd重组血凝素蛋白（rH5）在sf9昆虫细胞中实现了高效表达。rH5具有血凝活性,而且其血凝活性能够被H5N1禽流感病毒高免血清所抑制;rH5免疫鸡诱导产生针对H5N1禽流感病毒亚型特异的血凝抑制抗体,说明表达的重组蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性。     

渤海湾两株H2亚型禽流感病毒的 遗传进化分析

野鸟是禽流感病毒的自然储存库,病毒可以随着宿主的迁徙传播给其他野鸟与家禽。渤海湾是鸟类南北迁徙的重要停歇地,也是东亚-澳大利西亚鸟类迁徙通道的重要组成部分,每年有大量水鸟在渤海湾停歇,促进了禽流感病毒的传播。为了解渤海湾地区禽流感病毒的传播及进化与水鸟迁徙的相关性,2018年春季鸟类迁徙期间的4和5月份,在渤海湾采集鸻鹬类粪便样品2 120份,对样品进行检测,分离出2株H2亚型禽流感病毒。对这2株H2亚型禽流感病毒进行了分子特征及遗传进化分析,并结合渤海湾水鸟的环志回收数据,对H2亚型病毒的重组及遗传进化与水鸟迁徙的联系进行了分析。结果表明,2株分离株的HA蛋白裂解位点符合低致病性禽流感病毒的分子特征,它们的8个基因片段同源性均不高,其中879-H2N7的8个基因片段分别与我国福建和澳大利亚的毒株同源性最高,遗传关系最近;854-H2N8的8个基因片段分别与我国湖南以及日本、韩国、孟加拉国和越南的毒株同源性最高,遗传关系最近。渤海湾水鸟的环志回收数据分析表明,879-H2N7随着野鸟的迁徙在渤海湾、福建沿海和澳大利亚之间进行传播与扩散;854-H2N8可能跨越东亚-澳大利西亚和中亚-印度两条通道之间进行基因重组和进化,并会随着鸟类迁徙进行传播和扩散。     

禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短)、pET32a(+)/NA(截短)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2 HA、NA基因序列。为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。