二硫苏糖醇对叶绿体H~＋－ATP酶复合体CF_0的修饰

ＤＴＴ（二流苏糖醇）可解除ＴＰＴ（氯化三苯锡）对叶绿体光合磷酸化的抑制、减弱ＴＰＴ对类囊体跨膜△ｐＨ的抑制和对类囊体腔内质子外流的促进。由于ＴＰＴ较专一作用于ＣＦ０,推测ＣＦ０受ＤＴＴ修饰。这从ＤＴＴ可消除ＴＰＴ对去除ＣＦ１的类囊体残缺膜△ｐＨ的重建和对残缺膜光下收缩的促进得到进一步的证明。ＤＴＴ的作用是还原二硫键成为游离的巯基,因而ＣＦ０可能含有二硫键。从光下ＤＴＴ或暗中ＤＴＴ处理残缺膜对ＴＰＴ作用的影响,可以看到ＤＴＴ对ＣＦ０的修饰是需光的,类囊体膜在光下发生的构象变化,使ＣＦ０的二硫键暴露而被ＤＴＴ修饰。ＣＦ０的二硫键较ＣＦ１γ的二硫键更快、更敏感地被ＤＴＴ所修饰。     

三硝基甲苯对大鼠晶状体中可溶性蛋白质、巯基及二硫键含量的影响

我们采用三硝基甲苯（ＴＮＴ）与大鼠晶状体体外培养的方法,动态观察了晶状体中可溶性蛋白质、非蛋白质巯基、蛋白质巯基、蛋白质结合巯基及二硫键含量的变化,发现随着三硝基甲苯作用时间的延长,可溶性蛋白质、非蛋白质巯基及蛋白质巯基均减少,蛋白质结合巯基及二硫键交联的蛋白质含量增加,其中可溶性蛋白质、非蛋白质巯基及二硫键含量的变化皆达到了统计学上显著意义水平（Ｐ＜０．０５）。     

蛋白质中二硫键附近肽段识别规律研究

本文对蛋白质中二硫键附近的残基进行了计算机统计分析,结果发现平行和反平行残基间存在着特异的配对规律。这种残基间的相互作用或识别,可能与蛋白质折叠过程中正确地形成二硫键有关。该结果有助于蛋白质工程设计。     

中国南海堂皇芋螺毒素基因克隆及两个毒素的合成及活性研究

目的 研究中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)毒素基因序列,为毒素功能研究奠定基础。方法 采用Trizol法提取堂皇芋螺毒腺管的总RNA,应用3’端快速扩增cDNA末端(3’RACE)及巢式PCR技术,获得A、O、J超家族芋螺毒素新序列;或以A家族高度保守的内含子及3’端非翻译区(3’UTR)设计引物,克隆出新的α-芋螺毒素新序列。选择合成毒素ImIIA及Im1.2,测定ImIIA二硫键的连接方式,并测定两种毒素对神经型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的抑制活性。结果 获得11条毒素前体肽序列,分属A、O1、O2、J3等超家族,其中Im1.95为已报道芋螺毒素,其余为新发现芋螺毒素。ImIIA二硫键连接方式为少见的“C1-C2,C3-C4”,10μmol/L Im1.2、ImIIA对α2β2、α2β4、α4β2、α3β2、α3β4 5个nAChR亚型抑制活性较低。结论 通过基因克隆方法,从堂皇芋螺中获得了11个芋螺毒素,其中10个为新序列,属于A、O1、O2、J3等超家族毒素,Im1.2、ImIIA对神经型nAChR各受体亚型活性较低。     

Protein Disulfide Isomerase 2 of Chlamydomonas reinhardtii Is Involved in Circadian Rhythm Regulation

Protein disulfide isomerases （PDIs） are known to play important roles in the folding of nascent proteins and in the formation of disulfide bonds. Recently, we identified a PDI from Chlamydomonas reinhardtii （CrPDI2） by a mass spectrometry approach that is specifically enriched by heparin affinity chromatography in samples taken during the night phase. Here, we show that the recombinant CrPDI2 is a redox-active protein. It is reduced by thioredoxin reductase and catalyzes itself the reduction of insulin chains and the oxidative refolding of scrambled RNase A. By immunoblots, we confirm a high-amplitude change in abundance of the heparin-bound CrPDI2 during subjective night. Interestingly, we find that CrPDI2 is present in protein complexes of different sizes at both day and night. Among three identified interac- tion partners, one （a 2-cys peroxiredoxin） is present only during the night phase. To study a potential function of CrPDI2 within the circadian system, we have overexpressed its gene. Two transgenic lines were used to measure the rhythm of phototaxis~ In the transgenic strains, a change in the acrophase was observed. This indicates that CrPDI2 is involved in the circadian signaling pathway and, together with the night phase-specific interaction of CrPDI2 and a peroxiredoxin, these findings suggest a close coupling of redox processes and the circadian clock in C. reinhardtii.     

木聚糖酶EvXyn11TS耐热性与其N端二硫键的相关性分析

[目的]以糖苷水解酶11家族耐热木聚糖酶EvXyn11TS为研究对象,定点突变其编码基因Syxyn11,揭示EvXyn11TS耐热性与其N端二硫键的相关性.[方法]对不同来源的、与EvXyn11TS一级结构相似度较高的若干11家族木聚糖酶进行多序列同源比对,发现只有耐热的EvXyn11TS在其N端存在一个二硫键(Cys5-Cys32);运用分子动力学模拟预测该N端二硫键存在与否对木聚糖酶热稳定性的影响.以人工合成的Syxyn11为母本,采用PCR技术将其编码Cys5的密码子TGT突变为编码Thr5的ACT,构建去除了N端二硫键的突变酶(EvXyn11M)的编码基因Syxyn11M;分别将Syxyn11和Syxyn11M在毕赤酵母GS115中进行表达,并分析表达产物EvXyn 11 TS和EvXyn11M的温度和pH特性.[结果]酶学性质研究结果表明:EvXyn11M的最适温度Topt由突变前的85℃降至70℃;EvXyn11TS在90℃的半衰期t1/290为32 min,而EvXyn11M在70℃的半衰期t1/270仅为8.0 min.[结论]运用分子动力学模拟预测了N端二硫键对EvXyn11TS耐热性的重要作用,并通过定点突变验证之,为其它与耐热EvXyn11TS一级结构相似的、11家族常温高比活性木聚糖酶的耐热性改造提供了新的技术策略.     

单克隆抗体生产过程中二硫键还原成因及预防方法

单克隆抗体生产过程中二硫键的还原是生物制药领域中的一个常见技术难题,可产生低分子量碎片,影响产品质量,导致蛋白纯度降低、稳定性下降,影响药物的安全性和有效性。抗体二硫键还原实质上是由细胞内的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统引起的可逆氧化还原反应,并与具体生产过程参数有关。近年来,随着抗体药物和哺乳动物细胞培养工艺规模的发展,二硫键还原问题频繁发生。为解决此问题,研究人员不断尝试并建立了多种预防方法以保证产品质量。概述了抗体二硫键结构、二硫键还原的主要成因及生产过程中的形成因素,重点阐述了消除或减缓抗体二硫键还原的方法、对策,并列举了几种可行的过程分析技术,以期为单克隆抗体药物生产制造工艺的进一步优化提供参考。     

二硫键与蛋白质的结构

二硫键是肽链上2个半胱氨酸残基的巯基基团发生氧化反应形成的共价键．具有链内二硫键和链间二硫键2种形式。与氨基酸的氨基氮原子之间形成的稳定共价键不同．二硫键容易被还原而断裂,断裂后可再次氧化重新形成二硫键,因而是可以动态变化的化学键。二硫键是参与一级结构也是形成高级结构的重要化学键,对蛋白质折叠和高级结构的形成与维持十分重要。讨论了二硫键的形成和特征及其与蛋白质结构和功能之间的关系,并讨论了生物学教学中关于二硫键的一些疑问．     

人源抗狂犬病毒单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达

以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b( )载体,转化入E.coli BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。体外复性并经Ni-NTA亲和层析对目的蛋白ScdsFv进行纯化;利用荧光抗体实验和ELISA检测抗体活性及稳定性。结果表明重组ScdsFv蛋白实现了原核高效表达,通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度大于90%的ScdsFv蛋白。荧光抗体实验和ELISA结果表明ScdsFv具有特异的抗原结合活性,与母本ScFv比较,稳定性有明显提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定ScdsFv蛋白的获得为其进一步的功能研究提供了材料。