昆虫遗传转化品系的常用标记

遗传转化标记是将遗传修饰昆虫从野生型种群中分辨出来的根据,遗传转化昆虫的鉴定、转化品系的维持及其遗传稳定性的监测都依赖于可靠的标记系统,发展易于应用和监测的转化标记能够极大地促进害虫遗传防治的相关研究。用于遗传修饰昆虫的转化标记主要有昆虫眼睛颜色标记基因、抗药性标记基因和荧光蛋白标记基因等。非果蝇类昆虫首个遗传转化品系的鉴定是通过眼睛颜色突变而实现,但大多数昆虫物种没有可用的突变体或缺少相应基因的信息,从而限制了眼睛颜色标记的应用。抗药性基因标记虽然能够通过对转化昆虫进行集体选择而大幅度提高筛选转化体的效率,但由于其鉴定的准确性不高且存在安全性问题,未得到广泛应用。荧光蛋白标记基因的发展则显著拓宽了能够转化的昆虫种类。从水母分离的绿色荧光蛋白(GFP)经突变方法获得了多种不同荧光性质的突变体,经人为修饰后与适宜的强启动子构成转化标记载体,能够有效鉴定更多昆虫物种的遗传转化个体,其中应用较多的是增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。此外,从珊瑚属海葵中分离得到的红色DsRed标记基因提供了多样化的红色荧光蛋白选择,在某些生物中DsRed与GFP联合应用的表现明显优于GFP突变体,所以其应用前景也非常广泛。本文着重从眼睛颜色、抗药性和荧光蛋白等3个方面阐述了标记基因的发展历史与现状,并对其今后的发展方向进行了展望。     

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的鉴定、克隆及活性分析

【目的】鉴定我国自行分离的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）菌株中vip3A基因的分布和基因型,从其中对鳞翅目幼虫表现高毒力的Bt菌株中克隆vip3Aa基因。【方法】利用PCR-RFLP方法确定vip3A基因的分布和鉴定基因型,利用PCR方法克隆vip3A全长基因。【结果】171株野生型Bt菌株中共鉴定出63株含有vip3A基因,均与vip3Aa1类基因相似。从TF9和Bt16菌株中克隆得到2个vip3Aa基因,分别构建了携带vip3Aa基因的表达载体p30vip-26和p30vip-27,SDS-PAGE和Western Blot分析表明,IPTG诱导后均可表达88 kDa左右的Vip3A蛋白,蛋白可溶性分析表明约10%可溶。这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为vip3Aa26和vip3Aa27。生物测定结果显示,Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）3种重要鳞翅目害虫初孵幼虫的毒力较高,LC50值分别为0.125 μg/mL,0.238 μg/mL和9.238 μg/mL。而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾有活性,LC50值为4.423 μg/mL。【结论】本研究中的Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫均能表现高杀虫活性,而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾幼虫有活性,实验结果表明Vip3A蛋白个别氨基酸的变化对其杀虫活性影响很大。     

苹果蠹蛾热激蛋白Hsp90基因的克隆及热胁迫下的表达分析

世界检疫性害虫苹果蠹蛾Cydia pomonella是一种温度耐受可塑性很高的物种。本研究针对温度波动可能导致其耐热性增强的科学问题, 采用生测法鉴定了苹果蠹蛾实验种群的高温耐受阈值, 采用同源克隆、 RACE和实时荧光定量PCR (RT-qPCR)等方法研究了苹果蠹蛾热激蛋白Hsp90基因的应激表达对耐热性的重要作用。高温耐受阈值研究结果表明, 苹果蠹蛾实验种群的死亡率随温度的升高和时间的延长显著性升高, 1-5龄幼虫分别经50℃和52℃高温处理2, 5和10 min后, 3龄幼虫耐热性最差, 5龄幼虫最强。50℃和52℃分别处理10 min和5 min均可导致1-4龄幼虫全部死亡, 而5龄幼虫在这两种处理下仍有25.0%和11.1%的存活率。以35℃处理的5龄雌幼虫为材料克隆苹果蠹蛾Hsp90基因全长cDNA, 结果显示该基因全长为2 470 bp, 完整开放阅读框为2 148 bp, 共编码716个氨基酸, 预测分子量为82.07 kDa, 命名为Cphsp90 (GenBank登录号JN624775)。该基因编码的氨基酸序列与亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis和甘蓝夜蛾Mamestra brassicae等昆虫的Hsp90的氨基酸序列一致性高达96%, 表明了Hsp90家族的保守特性。Cphsp90 mRNA的相对表达量在32~44℃高温胁迫下随温度的升高而显著增高, 证实Cphsp90是诱导型热激基因, 且mRNA相对表达量与胁迫程度正相关。Cphsp90基因的表达还具有组织特异性, 35℃处理幼虫的表皮中Cphsp90相对表达量显著高于血淋巴、 脂肪体和中肠, 应激响应最为活跃。与未经温热预处理的昆虫相比, 35℃温热预处理3 h后的5龄幼虫在40, 45和50℃更高的温度胁迫下, Cphsp90 mRNA达到最高表达量所需要的胁迫温度有所提升, 由未经预热处理的40℃处理10 min提高到45℃处理10 min, 这与温热预处理会增强5龄幼虫耐热性的现象相符, 表明Cphsp90基因的响应表达在苹果蠹蛾耐热性及其可塑性过程中发挥重要的作用。     

苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV-CJ01的分离和鉴定

苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulovirus,CpGV)是控制苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)种群的重要生防因子。商业化产品病毒株单一,抗性的快速产生会降低CpGV的防效,高毒力或与之具有遗传差异的新病毒株可用于延缓病毒抗性的产生或发展,对苹果蠹蛾的控制策略具有重要作用。本研究从中国酒泉地区苹果园中的苹果蠹蛾野生种群及其实验室种群发病虫体中分离获得一株致病病毒,通过幼虫发病特征、病毒包涵体的形态学及分子生物学方法共同证实该病毒株为CpGV,且与CpGV-M相似,将其命名为CpGV-CJ01。其幼虫的发病体征具有CpGV感染的典型症状,包涵体的电镜形态学观察结果符合CpGV结构特征,利用分子生物学方法克隆得到Granulin基因和凋亡抑制蛋白基因(inhibitor of apoptosis protein,iap)均与CpGV-M具有99%以上的相似性,但是对于毒力的准确定量需要做进一步研究。我国新病毒株的发现为我国开展苹果蠹蛾颗粒体病毒的生物学防治创造了先决条件,并可作为延缓世界范围内CpGV抗性的候选菌株。     

苹果蠹蛾的综合防控和遗传控制研究进展

苹果蠹蛾是仁果类水果的重要检疫害虫,在世界各地造成了巨大的经济损失。目前对其化学防治、化学生态调控、病毒等防治方法研究较多,但仍不能满足防控该害虫的需要,对新型防控技术的需求日益增强。不育昆虫释放技术(SIT)是一种可控制甚至根除靶标害虫的环境友好型防控技术,但传统SIT技术存在一定的局限性,如较难区分性别与筛选雌雄虫、辐射不育昆虫的交配竞争力和适合度降低等问题,这些缺陷随着昆虫遗传修饰技术的发展将得以解决,并将在害虫防控进程中起到积极作用。本文综述了苹果蠹蛾主要防控技术研究现状,介绍了通过遗传修饰技术改善SIT的技术策略,并综合分析了我国开展苹果蠹蛾遗传修饰研究情况和将其应用在苹果蠹蛾防控体系中的可行性及优势。     

寄主植物信息化合物对苹果蠹蛾行为的影响及其在防控中的应用

苹果蠹蛾（Cydia pomonella)是仁果类水果的重要世界性害虫,也是我国的重要检疫性对象,在我国的发生、危害及潜在扩张的趋势十分严峻.有关寄主植物气味对苹果蠹蛾特异性引诱方面的研究受到了广泛的关注.本文综述了苹果蠹蛾和植物源气味之间的互作关系,主要包括寄主植物气味影响苹果蠹蛾成虫寄主定位、求偶交配和产卵等行为,幼虫取食对寄主植物气味释放以及寄主植物气味对性信息素的影响;同时还介绍了主要植物源化合物梨酯的研究和田间应用概况,以期为我国苹果蠹蛾的防控研究和应用提供参考.