大肠杆菌中高效表达rhBMP-4的探讨及初步活性测定

目的 在大肠杆菌中表达具有生物活性的rhBMP-4。方法 在不改变氨基酸序列的前提下,以全基因合成的方式对人BMP-4成熟肽基因全长进行定点突变,将之重组入pET-3c表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE)plysS。IPTG诱导和包涵体复性后,利用C2C12细胞横向成骨细胞分化实验以及小鼠肌袋异位骨形成实验检测其活性。 结果 获得0.348 kb的BMP-4 DNA序列,表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在。经纯化及复性后,体内与体外的活性检测表明rhBMP-4有良好的诱骨生成活性。结论 该方案能够实现rhBMP-4在大肠杆菌中的高效表达。     

在CHO细胞中表达具有高效成骨活性的BMP-2/7异源二聚体

PCR扩增BMP-2与BMP-7的编码基因, 利用重叠PCR以柔性肽(Gly4Ser)5编码序列将二者串连并克隆到质粒pIRESneo3上, 转染CHO-K1细胞得到混合稳定克隆。ELISA检测培养液中BMP-2/7异源二聚体蛋白的表达水平为230.75±13.34 ng/mL, 以此为条件培养基处理成骨细胞株MC3T3, 对照组为分别含有CHO-K1细胞及大肠杆菌表达的BMP-2同源二聚体以及PBS的条件培养基。结果发现碱性磷酸酶染色与茜素红染色差异明显, 定量RT-PCR显示分子指标OC、ALP、Runx2与Osx的转录水平明显增高(P<0.05), Luciferase报告基因检测BMP/Smad通路活性较对照组升高明显(P<0.05)。首次设计构建了BMP-2/7异源二聚体蛋白, 其成骨活性显著高于BMP-2同源二聚体。     

真核蛋白编码基因核心启动子元件

核心启动子（core promoter,CP）是位于转录起始位点附近由100个左右核苷酸所构成的功能区域,负责与转录因子结合同其它顺式作用元件如增强子、沉默子一起对转录进行调控。目前所发现的真核蛋白编码基因核心启动子元件包括：TATA盒、上游启动子元件BRE、起始子Initiator（Inr）、下游启动子元件DPE以及新发现的位于DPE附近的十基序元件MTE。上述核心启动子元件普遍存在于真核蛋白编码基因之中,对真核生物的生长、发育、适应环境起着重要作用。     

2种微小RNA实时定量PCR检测方法的比较

目的:对目前最常用的检测微小RNA(miRNA)的茎环实时定量PCR法和PAP实时定量PCR法进行比较。方法:分别用茎环实时定量PCR法和PAP实时定量PCR法检测人乳腺癌细胞MCF-7中U6和23种miRNA的表达,利用定量PCR分析软件和琼脂糖凝胶电泳方法,将2种方法在引物设计难度、特异性与灵敏度,以及检测通量方面进行比较。结果:茎环法的特异性和灵敏度比PAP法高,但引物设计难度大,检测通量低;PAP法引物设计难度较低,检测通量较高,但特异性和灵敏度较差。结论:茎环法实时定量PCR适于有针对性地检测小规模miRNA,而PAP法则适于大规模miRNA筛选实验。     

转录因子Osterix对成骨细胞Col1a1基因的反式激活作用

Osterix（Osx）是一种具有锌指结构的转录因子,对骨形成十分重要. 但到目前为止,直接接受Osterix调控的靶基因尚不清楚.用骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）诱导原代培养小鼠成骨细胞的骨分化,定量RT PCR检测Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ a 1, Col1a1)与Osx的转录水平.结果发现,二者的转录时相具有相同的变化模式.为了确定二者之间的关系,采用腺病毒表达系统在原代成骨细胞中过表达Osx. 数据表明,Osx能够明显上调Col1a1的转录水平.用EMSA（electromobility shift assay）检测这些过表达Osx基因的成骨细胞核抽提物,迁移条带的出现表明,Osx能够直接与Col1a1的启动子相结合.结果提示,在原代培养的成骨细胞中,Osterix通过直接与启动子相结合,调控Col1a1基因的转录.     

过表达Runx2促进C2C12细胞成骨分化

利用Tet-on(Tetracycline-on)基因表达系统,通过强力霉素(doxycycline,DOX)诱导Runx2基因在C2C12细胞中的表达,探究Runx2促成骨分化功能,为其分子机制的研究提供一个理想的实验平台.先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-Flag-Runx2转染入C2C12细胞,并用G418和潮霉素分别进行2轮筛选,运用实时荧光定量PCR选择对强力霉素诱导敏感的细胞克隆.用不同浓度DOX诱导C2C12/Tet/pTRE-Flag-Runx2细胞,蛋白免疫印迹检测Runx2的表达,确定DOX的最佳诱导浓度与时间,并检测C2C12细胞的成骨分化能力.结果表明,诱导细胞最佳DOX浓度为10μg/ml;最佳诱导时间为12h;诱导后Runx2基因高表达,C2C12细胞向成骨方向分化(P0.05).成功建立Tet调控Runx2基因表达C2C12细胞系,为进一步研究Runx2基因功能分子机制提供理想的细胞模型.     

人血小板源性生长因子受体β启动子的结构与功能分析

通过PCR扩增人血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)基因启动子片段,经双酶切后克隆到pGL3-basic载体构建了5个PDGFR-β基因启动子5′系列缺失重组载体,与作为内参的pRL-TK共转染人脐静脉内皮细胞(ECV304,HUVEC)后,通过荧光素酶活性检测鉴定出人PDGFR-β启动子中具有转录调控作用的2个活性区(-983～+53)和(+540～+1457),前者执行正调控,后者则起负调控作用.这2个转录活性区分别含有在人、大鼠、小鼠PDGFR-β基因启动子区都高度保守的区域A-box、B-box和C-box,凝胶迁移或电泳迁移率检测(EMSA)证实,核因子能与B-box*、C-box*特异结合.     

生物信息学分析及预测miR-17-92的分子调控网络

miR-17-92是一个高度保守的基因家簇,参与哺乳动物多个器官发育并与多种实体瘤的发生密切相关。运用多个在线数据库,发现了miR-17-92的上游转录因子及下游靶基因间的多个前馈和反馈环路。并对参与miR-17-92调控环路的基因进行功能聚类分析,进而绘制出miR-17-92的核心调控网络图。结果提示miR-17-92与其上游转录因子共调控的靶基因可能参与了生物体的细胞周期调控,迁移、凋亡、激素应答、免疫系统发育等多种生物学过程,KEGG pathway分析提示其还与多种肿瘤 信号通路密切相关。因此,对miR-17-92分子调控网络生物信息学的分析可以有助于理解其在细胞发育和肿瘤发生过程中的作用机制并为后续实验验证提供良好的指导。     

外源基因在大肠杆菌中的高效表达

为了提高外源蛋白在大杨杆菌中的表达量,人们对大肠杆菌表达系统进行了许多研究。作者综述了有关外源基因在大肠杆菌中高效表达的研究进展。     

人尿激肽原酶的纯化与鉴定

采用两性离子胶体沉淀和乙醇沉淀相结合的粗提方法,经离子交换、疏水层析、亲和层析及凝胶过滤4个步骤有效地将人尿激肽原酶（hk-1）粗提物纯化,比活提高了1 755倍,总得率为70%.用以慈菇蛋白酶抑制剂为配体的亲和层析纯化hk-1,效果理想,整个工艺路线适合产业化生产.纯化产物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上为单带,高压液相色谱(HPLC)上为单峰,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得分子质量为33 450 u,等电聚焦测得pI在4.3附近,为含糖蛋白.同时测定了该酶的热稳定性和pH稳定性.纯化过程中同时分离得到另一种药用蛋白——人尿胰蛋白酶抑制剂（HUTI）.