棉铃虫叉头框蛋白A类似蛋白基因HarmFoxAl的克隆及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并分析一种棉铃虫Helicoverpa armigera叉头框蛋白A (forkhead box protein A, FoxA)类似蛋白基因HarmFoxAl,探讨2-十三烷酮胁迫下棉铃虫中肠中HarmFoxAl的表达情况,为进一步明确棉铃虫FoxA的功能和参与棉铃虫生长发育的调控通路提供依据。【方法】从棉铃虫幼虫中肠中扩增得到HarmFoxAl的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HarmFoxAl的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌Escherichia coli Transetta菌株,IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并利用镍柱亲和层析法纯化融合蛋白。通过qPCR检测棉铃虫不同发育阶段(1-6龄幼虫和预蛹),6龄幼虫不同组织(脂肪体、中肠、体壁和头部)以及10 mg/g 2-十三烷酮处理6龄幼虫不同时间后中肠中HarmFoxAl的表达谱。【结果】HarmFoxAl(GenBank登录号:XM021331806)的开放阅读框为669 bp,编码222个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为25.03 kD和6.34。氨基酸序列分析表明,HarmFoxAl单体蛋白无信号肽、跨膜区和二硫键,核心区域是由4个α螺旋和3个β折叠组成的球状结构。将重组的Transetta (pET32a-HarmFoxAl)菌株用0.5 mmol/L IPTG在25℃条件下诱导5 h,约45 kD的融合蛋白His-HarmFoxAl能以可溶的形式存在于重组菌中,这与预测的分子量(42.8 kD)相一致。发育阶段特异性表达谱表明,HarmFoxAl在棉铃虫1-3龄幼虫期、6龄幼虫期和预蛹期均有表达,且预蛹期的表达量最高。组织表达谱结果表明,该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠和体壁中表达,且脂肪体内的表达量最高,而在头部中不表达。10 mg/g 2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠中HarmFoxAl的表达量显著降低,但随着时间延长其表达量逐渐升高,处理48 h后表达量显著高于对照。【结论】棉铃虫HarmFoxAl在预蛹期和幼虫脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理幼虫后HarmFoxAl的表达量急速降低后逐渐升高,推测其在棉铃虫变态发育和解毒代谢过程中发挥重要作用。     

棉铃虫Ⅰ型几丁质酶的表达

昆虫几丁质酶主要参与昆虫蜕皮、围食膜降解、细胞增殖、机体免疫防御、生长因子等重要生理生长发育过程。在本研究中,从NCBI下载棉铃虫几丁质酶序列,并克隆验证正确,构建的系统发育树表明属于Ⅰ型几丁质酶。将不包含信号肽的开放阅读框序列(1 707 bp)与pET28a载体连接,转化至大肠杆菌transetta(DE3)中进行诱导表达,Western blot进一步验证融合蛋白His-HaCHT。用镍柱子纯化融合蛋白,纯化获得的融合蛋白对胶体几丁质有降解活性,其酶活力为0.023μg/mL·s~(-1)。不同龄期的qPCR结果显示,该基因在棉铃幼虫的6个幼虫期以及预蛹蜕皮后均有表达,但HaCHTI在4龄和6龄幼虫阶段表达相对较高,而在1龄、2龄、3龄、5龄幼虫和预蛹表达量较低。这些结果表明,异源表达的棉铃虫的I型几丁质酶对胶体几丁质具有降解活性,可能对棉铃虫正常蜕皮有着重要的作用。     

棉铃虫中肠P450CYP6B6基因5'上游序列的克隆及序列分析

已证实2-十三烷酮等植物次生物质的胁迫会诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera)CYP6B6基因的过量表达[1].为探明棉铃虫P450 CYP6B6基因的表达调控机制,根据棉铃虫中肠P450 CYP6B6基因cDNA序列(GenBank登录号:AY950636),运用基因组步移的方法获得其5'上游区的序列,用启动子区的分析软件进行比对分析,结果得到棉铃虫P450CYP6B6基因5'上游区域1 333 bp的基因片段.分别运用NNPPv.2.2和TRANSFAC v.6.0预测转录起始位点及分析了转录因子结合位点,结果显示,该序列不仅包括TATA盒等这一类核心结构序列,还含有多个转录因子的结合位点,如GATA-1、Dfd、C/EBP、HSF、cytR和AhR(芳香烃受体化合物应答元件)等.该结果为深入研究棉铃虫P450 CYP6B6的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的研究奠定分子基础.     

棉铃虫β-actin基因的克隆、表达及多克隆抗体制备北大核心CSCD

克隆获得了棉铃虫β-actin基因,生物信息学分析表明,基因序列长1 131 bp,编码376个氨基酸,理论分子量为41.77 k D,理论等电点5.16。氨基酸序列与其他物种肌动蛋白比较有98%-99%的一致性,与鳞翅目的家蚕具有99%的一致性。分析棉铃虫β-actin和小家鼠β-actin的抗原决定簇位点,发现两者抗原表位有70.63%的一致性。同时原核表达、纯化了棉铃虫β-actin蛋白,Western-blot结果表明表达正确。将纯化后的蛋白免疫ICR小鼠4次后,小鼠抗血清效价最高可达388 800,并且能与天然棉铃虫蛋白特异性结合。     

荒漠拟步甲科鳖甲族三种幼虫头壳色素区的观察

荒漠拟步甲科鳖甲族昆虫的幼虫具有相似的圆柱状体形,从形态上不易区别。以往对荒漠拟步甲幼虫的形态研究注重于上唇和足等部位的刚毛和小刺的特征,少有对头壳颜色的记载。通过在体视显微镜下观察室内饲养的鳖甲族昆虫(鞘翅目:拟步甲科)小胸鳖甲Microdera punctipennis Kaszab、光滑鳖甲Anatolica polita borealis Kaszab和细颈露颚甲Colposcelis microderoides microderoides Reitter的大龄幼虫,发现它们的头壳色素区呈现出不同的形状和大小,可方便地用于区分这3种幼虫。同时,测量结果显示幼虫头壳宽与前胸背板宽之比在这3种幼虫有显著差异。     

学习对广赤眼蜂寻找寄主和接受寄主行为的影响

比较研究了广赤眼蜂雌蜂羽化后不同时间、有无产卵经历、有无交配经历等对其搜寻寄主和检验寄主所需的时间的影响.羽化后48～72小时的雌蜂所用的搜寻时间和检验卵的时间显著比羽化后0～48小时的雌蜂长;有产卵经历的雌蜂所用的搜寻时间和检验时间显著比没有产卵经历的雌蜂短;交配与否不影响雌蜂用于搜寻寄主和检验寄主的时间.     

新疆棉铃虫赤眼蜂种系筛选——对寄主的选择性

对寄生棉铃虫的暗黑赤眼蜂(Tnchogramma pintoi)和广赤眼蜂(T.eianescens)等2蜂种的6个地理品系(4个采自新疆棉铃虫,2个从乌孜别克斯坦引进)进行了寄主选择性测定.当同时面临棉铃虫卵和米蛾卵时,根据接触卵次数和寄生量等特性,暗黑赤眼蜂乌兹别克Ⅱ品系对棉铃虫卵表现很强的选择性,其次是暗黑赤眼蜂库尔勒品系,其余品系对棉铃虫卵的选择性不明显或对米蛾卵表现强选择性.     

新疆棉铃虫赤眼蜂种系筛选-对温湿度的反应

对采自新疆棉铃虫的2个暗黑赤眼蜂地理品系和1个广赤眼蜂品系以及从乌孜别克斯坦引进的2个暗黑赤眼蜂地理品系进行了对温湿度反应的比较研究.各赤眼蜂种(系)后代性比之间的差异受温湿度组合的影响较小.同一种系中,雌蜂倾向于在较高温度下产更多的卵,达到更高的寄生率,但性比(雄/雌)随温度升高而增大.在高温(35℃)低湿(45%)条件下,暗黑赤眼蜂吐鲁番品系的后代中雌性所占比较最高,其羽化率和发育历期与最高的种(系)无显著差异,尽管其寄生率仅次于最高的暗黑赤眼蜂喀什种群.说明赤眼蜂吐鲁番种群最能适应新疆高温干旱的气候环境,是一比较好的侯选品系.     

棉铃虫Ⅰ型和Ⅶ型几丁质酶基因表达规律的比较分析

几丁质酶（chitinase, CHT）在昆虫生长发育过程中主要有降解围食膜、外骨骼、角质层以及肠道内层的几丁质成分,从而参与昆虫的蜕皮和细胞增殖的功能。在本研究中,分析比较棉铃虫I型和Ⅶ型几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域及其时空表达特性,对的进一步功能研究提供重要的素材。首先利用生物信息学在线工具SMART对本课题组前期所获得的几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域进行分析;之后采用qRT-PCR方法研究棉铃虫6龄幼虫不同组织和幼虫不同龄期蜕皮前后的中肠中HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的时空表达特性。结果表明：对几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ结构域进行分析,发现HaCHTⅠ和HaCHTⅦ均具有信号肽序列、催化区域、连接区域,且HaCHTⅠ有一个几丁质结合结构域,而HaCHTⅦ则无;棉铃虫Helicoverpa armigera几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ在6龄幼虫不同组织部位的均有表达,其中HaCHTⅠ在各个部位的表达量没有显著的差异,而HaCHTⅦ在头壳和体壁中表达显著高于其它组织;几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ在棉铃虫幼虫蜕皮前后中肠的表达量变化较大,其中HaCHTⅠ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递减的趋势,在4、5、6龄初期时表达量则是先减后增的趋势,而HaCHTⅦ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递增的趋势,恰与同一时期HaCHTⅠ的表达量相反,在4、5、6龄初期时HaCHTⅦ的表达量呈递减的趋势。棉铃虫HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的结构域和时空表达都存在差异,据此我们测这些差异可能对其功能具有一定的影响。本结果为深入研究几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的功能奠定了基础。     

荒漠甲虫小胸鳖甲几丁质酶基因MpCht8c的克隆、鉴定与低温表达

为了挖掘荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis的耐寒性相关基因,从其4℃转录组数据库筛选出差异表达的几丁质酶基因片段394seq2,检测其编码蛋白的几丁质酶活性,研究该基因的表达对低温胁迫的响应情况。采用RACE技术扩增394seq2的5′端和3′端,克隆全长序列,将其ORF构建至原核表达载体pET28a,导入Transetta(DE3)感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot法检测表达蛋白的正确性;二硝基水杨酸法测定几丁质酶活性,qRT-PCR技术探究低温表达谱。结果表明,394seq2的5′-UTR为39 bp,3′-UTR为181 bp;ORF为1 140 bp。系统进化树显示该序列与赤拟谷盗几丁质酶8(TcCHT8)聚为一支,命名为MpCht8c。MpCht8c编码379个氨基酸,分子量为41.2 kDa,理论等电点pI为4.67。MpCHT8c含有完整的几丁质酶结构基序,其N端含有几丁质酶催化域,内有一个类18家族几丁质酶的保守基序KXXXXXGGW,中部是一段富PEST的连接区,C端是几丁质酶结合域,属于IV型昆虫几丁质酶。Western blot结果表明His-MpCHT8c在大肠杆菌中正确表达;融合蛋白粗酶液的几丁质酶活性为1.89 U/mL。在4℃冷胁迫0.5 h和5-9 h时Mpcht8c出现两个上调表达峰值,约为对照的2倍。研究表明荒漠昆虫小胸鳖甲的几丁质酶MpCHT8c具有几丁质酶活性,MpCht8c基因的表达可快速响应4℃低温胁迫。研究结果有助于深入研究几丁质酶在小胸鳖甲耐寒性方面的作用机理。