人滑膜间充质干细胞与人脐带间充质干细胞的生物学性状比较

该文旨在比较人滑膜间充质干细胞(human synovial mesenchymal stem cells,hSMSCs)与人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的生物学性状。流式细胞仪鉴定hSMSCs和hUC-MSCs。比较两种间充质干细胞的增殖、分化、迁移能力。结果表明,hSMSCs和hUC-MSCs均为长梭形贴壁细胞,并表达多种间充质干细胞表面标志物。不同的是,hUC-MSCs高表达CD73、CD105、CD147;而hSMSCs高表达CD24。hSMSCs具有更强的早期成骨和成软骨能力。hUC-MSCs具有更强的增殖和迁移能力,细胞周期结果显示,hSMSCs和hUC-MSCs均具有较强的增殖能力。该研究成功分离出hSMSCs,其生物学性状与hUC-MSCs相似,且具有较强的成骨与成软骨能力,可作为组织工程的理想种子细胞或临床治疗用细胞。     

人尿源性干细胞的分离培养及应用研究新进展

人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)是从人尿液中通过常温离心分离培养出来的具有良好增殖活性和多向分化能力的成体干细胞,具有间充质干细胞的生物学特性,其在组织器官修复、疾病治疗、药物活性及毒性替代筛选等领域均有重要的应用前景,且已能实现多种途径向尿源性多潜能干细胞(urine-induced pluripotent stem cells,u-iPSCs)转化,但在研究过程中发现仍然存在一些值得深入研究的问题,如人尿液源性干细胞的来源尚不明确,定向诱导多潜能干细胞分化的条件选择及如何提高重编程效率等.本文对hUSCs的来源、分离培养方法、生物学特性及其应用研究最新进展进行综述,总结了由hUSCs向u-iPSCc诱导的方法及其应用前景,为hUSCs的研究和应用提供参考.     

脐带间充质干细胞——组织工程的新视角

目的 从脐带中分离培养脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC) 并进行鉴定,阐明其多向分化的潜在作用.方法 收集健康胎儿脐带,分离培养脐带中的间充质干细胞,以流式细胞仪对培养的间充质干细胞进行细胞表面标志检测,多种成分联合诱导其向脂肪、成骨方向分化,细胞化学染色检测诱导后的细胞变化.结果 脐带中分离培养的间充质干细胞不表达造血细胞系的标志CD34、CD45、HLA-DR,强表达CD105、CD44、CD90,在适当的诱导条件下可向脂肪及成骨方向分化.结论 脐带中存在具有多向分化潜能的间充质干细胞.     

人尿源干细胞的分离与鉴定

为建立高效简便的人尿源干细胞(Human urine-derived stem cells,hUSCs)培养和鉴定体系,在无菌条件下收集青年志愿者的尿液分离培养人尿源干细胞,然后用克隆计数、形态观察、核型分析、生长曲线测定、表面标志物检测、成骨和成脂分化等方法对hUSCs进行鉴定。人尿源干细胞克隆具有纤维样、鹅卵石样和丝连样三种形态。第二代hUSCs高表达抗原CD44、CD73和CD90,阳性率均高于99.6%;而低表达抗原CD34和CD45,阳性率均低于0.3%。第六代hUSCs高表达抗原CD44和CD73,阳性率均高于99.5%;而低表达抗原CD34和CD45,阳性率均低于0.5%。第六代hUSCs仍然具有很强的增殖能力和稳定的核型,并经诱导可分化为骨细胞和脂肪细胞。该研究建立了高效简便的hUSCs培养和鉴定体系。     

人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定简

目的：建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法,并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。方法：收集健康足月产胎儿脐带组织,采用组织块贴壁法进行原代培养,流式细胞仪对其表面标志进行检测,通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定,RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin进行检测。结果：采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞,培养的细胞经流式细胞仪检测,高表达CD29、CD44、CD105、CD106,低表达CD34、CD45;经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞,RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。结论：人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养,具有多向分化潜能,可作为组织工程种子细胞来源。     

原子力显微镜对人羊膜间充质干细胞成脂分化的观察

观察人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)成脂分化前后超微结构及其机械性能的变化,以期进一步了解hAMSCs在体外成脂分化的过程。用流式细胞仪分析细胞表面分子表达情况,油红O染色检测hAMSCs成脂分化情况,原子力显微镜观察(AFM)分化前后超微结构及机械性能的变化等。结果显示,流式细胞检测显示,CD34,CD45,HLA-DR,呈阴性表达,CD29,CD90呈阳性表达;油红O染色可见脂肪细胞胞质中有大小不等的圆性红色脂肪滴;AFM观察诱导后的hAMSCs表面有脂滴状的颗粒,粘弹力增大,硬度减小。运用AFM可以清晰观察到诱导前后形貌及机械性能变化。     

牛脂肪间充质干细胞的分离、培养与鉴定

为了给组织工程提供种子细胞,对牛间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)进行体外分离培养。首先应用胶原酶消化法分离牛ADSCs,进行体外培养、连续传代,并观察细胞的形态变化,通过细胞计数绘制生长曲线,细胞压片进行染色体分析,采用细胞免疫荧光化学方法检测细胞表面标记,利用成骨分化和成脂分化检测其分化能力。结果显示牛ADSCs体外培养时细胞形态呈成纤维细胞样,增殖稳定;Vimentin、CD49d、CD13表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性高,茜素红染色呈阳性;成脂诱导条件下细胞周围脂滴明显,油红-O染色呈阳性。结果证明牛ADSCs体外生长稳定、增殖速度快、定向分化能力强,简易的体外分离培养及诱导方法为其在组织工程中的应用奠定了基础。     

人羊水来源干细胞与骨髓间充质干细胞的对比研究

该研究对比人羊水来源干细胞(human amniotic fluid derived stem cells,hAFSCs)和人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)的细胞表型及成骨分化能力。分离培养hAFSCs和hBMSCs,通过光镜观察,CCK-8检测,流式细胞术,基因芯片等方法对比两组细胞表型,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,茜素红(alizarin red S,ARS)染色,Real-time PCR,细胞免疫荧光等方法对比两组细胞体外成骨分化过程,再进一步通过裸鼠异位成骨来初步检测两种细胞体内成骨能力。结果显示,hAFSCs与hBMSCs在镜下均表现为梭形,且具有相似的增殖能力,都表达CD90和CD105,成骨诱导下两种细胞ALP活性及矿化结节均随着时间增加,同时成骨标志物RUNX2、OSX、COL I、ALP、OPN的mRNA水平也增高。基因芯片分析表明,两者在细胞黏附以及炎症反应方面的基因表达存在差异。类似地,体内裸鼠异位成骨结果也表明,hAFSCs与hBMSCs具有相近的成骨分化潜能。总之,人羊水来源干细胞与人骨髓间充质干细胞具有相似的细胞形态及增殖能力,均能在体内外成骨诱导分化环境下展现出良好的成骨功能。     

经血源子宫内膜干细胞培养、鉴定及体外分化潜能的研究

现阶段干细胞的来源常具有侵入性,该文旨在研究新来源于经血的经血源子宫内膜干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs）的基本生物学特性及分化潜能。采用密度梯度法从女性经血中分离MenSCs,测定MenSCs群体倍增时间,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,免疫荧光法检测MenSCs nestin阳性表达情况,体外验证其成骨成脂分化潜能。结果表明,MenSCs具有典型的梭状结构,细胞倍增时间为32.2 h,均一地高表达CD29、CD90及CD105,不表达CD14、CD45、HLA-DR。免疫荧光表明,MenSCs为nestin阳性。MenSCs成脂诱导后,油红O染色为阳性。成骨诱导前期诱导组细胞胶原表达量升高,诱导两周后MenSCs形成钙结节,诱导组细胞ALP（alkaline phosphatase）活性连续3周呈上升趋势。以上证明,MenSCs具有来源广泛的优势,具有较高的增殖能力、较低免疫原性、nestin阳性及多向分化潜能等特性,可成为干细胞治疗的理想种子细胞。     

比较两种不同来源间充质干细胞的生物学特性及多向分化潜能

该文旨在比较人脂肪间充质干细胞(hADSCs)和脐带间充质干细胞(hUMSCs)的生物学特性,并鉴定其多向分化潜能。体外扩增培养hADSCs和hUMSCs,绘制细胞生长曲线并计算群体倍增时间,通过细胞集落实验比较两种细胞的增殖能力,流式细胞仪和RT-PCR方法分别检测细胞表面抗原和多能性相关基因的表达,采用成脂、成骨诱导分化试剂盒比较两种细胞的分化潜能。hADSCs和hUMSCs表达CD34、CD44、CD45、CD105的比例分别为2.7% vs 6.2%、92.3% vs 93.4%、1.3% vs 3.1%、99.4% vs 98.0%,均表达Oct4和Nanog基因;生长曲线均呈"S"型,两种细胞的群体倍增时间差异不显著(P0.05);随着代数的增加,两种细胞的增殖能力均变弱,但P7的hADSCs的增殖能力要显著优于hUMSCs(P0.05);经油红O、茜素红染色及RT-PCR和细胞免疫荧光方法检测特异基因的表达,表明两种细胞均具备成脂、成骨分化的能力,hADSCs的成脂能力优于hUMSCs,但两种间充质干细胞的成骨分化能力没有显著性差异。hADSCs和hUMSCs具有相似的生物学特性,但hADSCs可能具备更强的增殖能力和成脂分化潜能。     

SFRP5抑制BMP9诱导人脐带间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的:探讨脂肪因子分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein 5,SFRP5)对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)成骨分化的影响。方法:将人脐带间充质干细胞根据不同的处理因素分为4组:对照组、BMP9组、BMP9+SFRP5组和SFRP5组;分别在3天、5天和7天进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性读数,7天进行ALP染色,21天进行茜素红染色检测钙盐沉积及油红O染色;收集不同组的细胞用于裸鼠皮下注射成骨模型的建立,4周后取出离体骨进行Micro-CT扫描和分析,获取的标本进行HE、Masson染色,Alcian blue染色及油红O染色检测。Western blot检测成骨分化相关蛋白Runx2和OPN的表达。结果:BMP9组的ALP活性读数和染色结果和茜素红染色结果均较对照组增加,而BMP9+SFRP5组则较BMP9组降低;BMP9处理后出现少量脂滴,而BMP9+SFRP5组脂滴明显增加,SFRP5组脂滴最多;裸鼠皮下注射成骨模型的观察结果显示,对照组和SFRP5组没有形成肉眼可见的皮下包块,BMP9组和BMP9+SFRP5组能生成异位骨;4周后观测大体标本以及进行MicroCT检测,发现BMP9+SFRP5组的骨密度值小于BMP9组(P0.05)。HE、Masson染色,Alcian blue染色结果显示,BMP9组的骨分化程度大于BMP9+SFRP5,油红O染色结果示BMP9+SFRP5组有较多的成脂分化;SFRP5能抑制BMP9诱导的Runx2、OPN的蛋白质表达。结论:SFRP5抑制BMP9诱导的人脐带间充质干细胞成骨分化。     

IL-17对人脐带间充质干细胞体外免疫调节特性的影响

目的:研究白细胞介素17(IL-17)对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的免疫调节能力的影响。方法:采用组织块贴壁法从健康足月胎儿脐带中分离培养hUC-MSCs,并对其进行鉴定。然后在培养基中加入不同浓度IL-17,采用EdU细胞增殖法检测hUC-MSCs增殖情况,流式细胞术(FCM)检测h UC-MSCs表面标记及细胞周期,RT-qPCR检测免疫调节相关基因表达水平,ELISA检测上清中免疫调节相关因子分泌水平,免疫学反应检测其免疫调节能力。结果:①倒置显微镜下观察可见hUC-MSCs呈现较均一漩涡状、梭形生长,细胞体积较小;细胞表面表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD19、CD11b、CD45、HLA-DR;具有成脂、成骨、成软骨诱导分化能力。②FCM检测结果显示IL-17处理后,hUC-MSCs免疫表型未发生变化,而IFN-γ处理后,hUC-MSCs表面标记HLA-DR表达明显上调。③与对照组相比,IL-17处理组的hUC-MSCs活性更好,且能促进细胞增殖。④与空白对照组相比,IL-17处理组h UC-MSCs的TGF-β、IL-10、IDO、PGE2、TSG-6、PD-L1基因表达均显著上调(P<0.001)。⑤ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,IL-17处理组上清中TGF-β、IL-10、IDO、PGE-2、TSG-6、PD-L1分泌水平明显增高(P<0.001)。⑥与空白对照组相比,IL-17处理组的CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、B细胞的比例降低,Treg细胞比例增高(P<0.001)。结论:IL-17在不影响hUC-MSCs免疫表型的条件下,可促进细胞增殖,上调免疫相关基因表达,提高TGF-β、IL-10、PGE-2、IDO、TSG-6、PD-L1分泌水平,增强hUC-MSC免疫调节能力。因此,本研究将为预处理的hUC-MSCs防治免疫炎症性疾病提供理论依据。     

mitoTEMPO改善糖尿病小鼠脂肪干细胞的氧化损伤

目的:探讨线粒体靶向抗氧化剂mitoTEMPO对糖尿病小鼠脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)氧化损伤的影响。方法:采用60%高脂饮食喂养雄性C57小鼠(4周龄)连续8周,并在高脂喂养第2周,对小鼠进行连续5天腹腔注射低剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(25 mg·kg-1)制备2型糖尿病小鼠模型。喂养2周后,检测小鼠血浆葡萄糖水平等指标符合2型糖尿病标准者纳入实验。分别从正常小鼠与STZ诱导的糖尿病小鼠的腹股沟处皮下脂肪组织分离培养脂肪干细胞(ADSCs),并将其各分为4组:DMEM培养的正常ADSCs组(nADSCs组),DMEM培养的糖尿病ADSCs组(dADSCs组),TEMPO治疗的糖尿病ADSCs组(T-dADSCs组),mitoTEMPO治疗的糖尿病ADSCs组(mitoT-dADSCs组)。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞存活能力;油红-O和茜素红染色分别检测成脂细胞分化与成骨细胞分化能力;划痕实验和Transwell试验分别测定细胞迁移能力;DCF和mito SOX染色荧光成像分别检测细胞内和线粒体中的活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)水平。结果:①与nADSCs组相比,d ADSCs组的细胞活力明显下降(P0.05)、成骨细胞分化与成脂细胞分化程度明显下降(P0.05)、脂肪干细胞迁移能力明显下降(P0.05)、细胞内和线粒体中ROS水平明显升高(P0.05)。②与dADSCs组相比,T-dADSCs和mitoT-dADSCs组的细胞内和线粒体中的ROS水平明显降低(P0.05);与dADSCs组相比,mitoT-dADSCs组的成骨细胞分化与成脂细胞分化能力明显提升(P0.05),基本达到nADSCs组的分化水平;与dADSCs组相比,mitoT-dADSCs治疗组的细胞迁移能力显著升高(P0.05)、T-dADSCs组的细胞迁移能力增长无明显差异。结论:mitoTEMPO可以减轻糖尿病时线粒体内活性氧簇蓄积造成的脂肪干细胞的氧化应激损伤与功能紊乱。     

鞘氨醇-1-磷酸对人脐带间充质干细胞增殖及表面标记物表达的影响

鞘氨醇－1－磷酸（sphingosine－1 phosphate, S1P）是一种脂质信号分子,与细胞增殖、凋亡和迁移等有密切关系．本研究发现,S1P促进人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC－MSCs)增殖,但目前关于其作用信号通路及S1P对hUC－MSCs表面标记表达的影响尚不十分清楚．Real－time PCR检测hUC－MSCs中S1P受体mRNA表达情况,发现在hUC－MSCs中优势表达S1PR1 3,而S1PR4、S1PR5的表达很少．MTT法检测S1PR1/3拮抗剂VPC23019、S1PR2拮抗剂JTE013、S1PR3拮抗剂CAY10444、Gi蛋白抑制剂PTX和ERK抑制剂PD98059对S1P诱导hUC－MSCs增殖的影响．结果显示,VPC23019完全抑制S1P诱导的hUC MSCs增殖,JTE013对此没有明显影响,CAY10444部分抑制S1P诱导的hUC MSCs增殖,PTX、PD98059完全抑制S1P诱导hUC－MSCs增殖．进一步用Western印迹检测ERK1/2磷酸化水平揭示,S1P通过促进ERK1/2磷酸化进而促进hUC MSCs增殖．流式细胞术检测发现,S1P对hUC MSCs表面标记物(CD45、CD34、CD90、CD29、CD105、CD44、CD73、CD71)表达没有明显影响．本研究证明,S1P通过S1PR1/3、Gi偶联蛋白及ERK1/2信号通路促进hUC MSCs增殖,而对hUC MSCs表面标记物表达无明显影响．     

骨髓来源的间充质干细胞分化能力的鉴定

本文研究了人骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)的成骨及成脂分化的潜能.通过加入诱导成骨的诱导剂,人的MSCs出现成骨分化的机箱,通过碱性磷酸酶活性测定,茜素红染色及主要调控基因BMP2和Runx2的表达,确定了MSCs具有成骨分化的潜能.对于成脂分化,通过油红O染色,及主要标志基因PPARγ的表达确定其具有成脂分化的潜能.所以,从骨髓分离的到的MSCs纯度达到标准,并且具有成骨成脂分化的多向潜能,是一种理想的实验模型细胞.     

脂肪干细胞的诱导分化及其来源的研究

目的:通过组织块培养法得到脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),探讨其诱导分化潜能,并初步研究ADSCs的来源。方法:用脂肪组织块培养法培养原代人ADSCs。第三代ADSCs进行成脂和成骨诱导分化,分别用油红O和茜素红S染色进行鉴定。脂肪组织块培养七天后取脂肪组织进行Hematoxylin-eosin Staining(HE)染色观察ADSCs组织分布。结果:用脂肪组织块培养法成功培养出原代人ADSCs。ADSCs传代到第8代,依然保持着良好的增殖能力和细胞形态。ADSCs能成功诱导成脂肪细胞和骨细胞。通过对培养七天后的脂肪组织块进行HE染色,发现ADSCs主要分布在脂肪组织的间质血管和结缔组织周围。结论:用脂肪组织块培养出来的ADSCs具有成脂和成骨分化的潜能。ADSCs主要定位于间质血管和结缔组织周围。