核酸酶P1的原核表达、纯化及酶学特性分析

为了建立一种核酸酶P1(Nuclease P1,NP1)的原核表达纯化系统,首先采用重叠延伸PCR将22段寡核苷酸拼接,获得人工合成的NP1基因。将其克隆至分泌型表达载体pMAL-p4X获得重组质粒pMAL-p4X-NP1,然后将重组载体转化T7 Express和Origami B(DE3)菌株诱导表达,利用Amylose亲和层析柱纯化获得重组蛋白,并对其活性、热稳定性和金属离子依赖性进行系统分析。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白MBP-NP1(Maltose binding protein-NP1)在T7 Express和Origami B(DE3)菌株中均可表达,且以可溶性形式存在。活性检测表明Origami B(DE3)菌株中获得的重组蛋白活性高于T7 Express菌株(75.48 U/mg:51.50 U/mg);利用蛋白酶Factor Xa切除MBP标签后,两种重组蛋白的比活力均有提高,分别为258.13 U/mg和139.20 U/mg。重组NP1表现出良好的热稳定性,80℃温浴30 min后重组酶仍具有90%以上的活力。2.0 mmol/L Zn2+对NP1有比较明显的激活作用,相同浓度的Cu2+则对该酶有强烈的抑制作用。该研究实现了NP1在大肠杆菌系统中的功能性表达,为NP1纯酶的制备提供一个替代途径。     

真菌线粒体cob中Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶进化分析

以已公布的114种真菌线粒体基因组数据为依据,对cob内含子及其编码的Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶进行全面分析,以揭示其进化规律。在cob内含子中共发现27个Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶基因,其中18个位于S433内含子插入位点,其余9个散布在另外8个插入位点。结合Pfam数据,将Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶分成10个主要类群,其中4个类群存在不同生物界物种间的水平迁移。S433位点的18个归巢内切酶均属于类群1,它们与宿主内含子可能从共同祖先垂直遗传而来,并在传递过程中伴有水平迁移;其他归巢内切酶及宿主内含子则应是水平迁移的结果。类群1中的归巢内切酶可分为两个亚类,两亚类识别的靶序列存在明显差异;保守模体氨基酸序列分析显示它们大多数具有潜在内切酶活性。全面呈现了真菌线粒体cob内含子及其编码的Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶的存在状态和进化模式,为归巢内切酶的改造和设计提供了新素材。