亚硝基胍消除链霉菌FR-008的线性质粒

【目的】利用亚硝基胍(NTG)消除链霉菌FR-008线性质粒以简化其基因组,获得背景清晰的菌株,作为抗生素异源生物合成的底盘细胞。【方法】NTG溶液处理链霉菌FR-008孢子悬液,从存活的诱变株中筛选砷敏感的突变株,再通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测线性质粒是否被消除;用生测实验定性检测各个线性质粒消除突变株杀念菌素合成的能力,最后通过HPLC定量比较突变株和野生型产生杀念菌素的差异。【结果】从103个诱变株中筛选到3株砷敏感的突变株(10#、59#、115#)。PFGE检测发现它们均丢失了大线性质粒p SSFR1,此外,42#突变株的小线性质粒p SSFR2被消除,在此基础上,第二轮NTG诱变获得了双质粒消除的突变株。大线性质粒p SSFR1消除率约为3%,小线性质粒p SSFR2消除率约为1%。发酵结果显示:10#、115#突变株杀念菌素有效组分III产量分别提高了40%和30%。【结论】首次发现NTG是一种有效消除链霉菌线性质粒的诱变剂,2株大线性质粒消除的突变株杀念菌素的产量得到提高。此方法可以用来消除特定链霉菌菌株中的巨型线性质粒以高效简化其基因组,因而是一种有效的抗生素遗传育种的方法。     

CMP羟甲基化酶MilA中与甲基羟化过程相关的关键氨基酸定点突变分析

【目的】米多霉素生物合成起始反应的MilA蛋白可以使底物胞苷酸单磷酸(CMP)的胞嘧啶碱基C5位上形成羟甲基化,形成羟甲基化胞苷酸(HmCMP),MilA是迄今发现的首个能够高效利用CMP的羟甲基化酶。MilA属于脱氧胸苷酸合成酶(TS)和脱氧胞苷酸羟甲基化酶(CH)蛋白超家族,通过三维结构预测发现它们的三维结构非常相似,CH94上的丝氨酸曾被证明与胞嘧啶上甲基变成羟甲基过程有关,MilA102上对应的氨基酸为苏氨酸,TS91上对应的氨基酸为脯氨酸。因此,突变MilA上第102位的苏氨酸,考察该氨基酸对CMP和脱氧胞苷酸(dCMP)羟甲基化反应的影响。【方法】通过定点突变技术,将MilA第102位的保守氨基酸苏氨酸(Threonine,T)分别点突变成缬氨酸(Valine,V)和亮氨酸(Leucine,L)。【结果】体外酶活实验结果显示,相对于MilA,MilA T102V对于CMP的催化活性下降87.1%,对于dCMP的催化活性没有影响;而MilA T102L均丧失了对于两种底物的活性。【结论】这表明Thr102对于MilA催化底物CMP形成HmCMP至关重要;同时,失去活性的仅比缬氨酸和野生型苏氨酸的链长多出了一个碳原子,暗示其在与底物结合时形成了一定的空间位阻效应。Thr在102位点的功能经过自然进化的微调有可能已经达到最优化。