| CMP羟甲基化酶MilA中与甲基羟化过程相关的关键氨基酸定点突变分析 |
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| 引用本文： | 高土玲,陈诚,赵功,邓子新,胡申才,贺新义.CMP羟甲基化酶MilA中与甲基羟化过程相关的关键氨基酸定点突变分析[J].微生物学通报,2014,41(1):50-57. |
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| 作者姓名： | 高土玲 陈诚 赵功 邓子新 胡申才 贺新义 |
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| 作者单位： | 1. 武汉工业学院 生物与制药工程学院 湖北 武汉 430023 2. 上海交通大学 生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室 上海 200030;2. 上海交通大学 生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室 上海 200030;2. 上海交通大学 生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室 上海 200030;2. 上海交通大学 生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室 上海 200030;1. 武汉工业学院 生物与制药工程学院 湖北 武汉 430023;2. 上海交通大学 生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室 上海 200030 |
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| 基金项目： | 国家973计划项目(No. 2012CB721004) |
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| 摘 要： | 【目的】米多霉素生物合成起始反应的MilA蛋白可以使底物胞苷酸单磷酸(CMP)的胞嘧啶碱基C5位上形成羟甲基化,形成羟甲基化胞苷酸(HmCMP),MilA是迄今发现的首个能够高效利用CMP的羟甲基化酶。MilA属于脱氧胸苷酸合成酶(TS)和脱氧胞苷酸羟甲基化酶(CH)蛋白超家族,通过三维结构预测发现它们的三维结构非常相似,CH94上的丝氨酸曾被证明与胞嘧啶上甲基变成羟甲基过程有关,MilA102上对应的氨基酸为苏氨酸,TS91上对应的氨基酸为脯氨酸。因此,突变MilA上第102位的苏氨酸,考察该氨基酸对CMP和脱氧胞苷酸(dCMP)羟甲基化反应的影响。【方法】通过定点突变技术,将MilA第102位的保守氨基酸苏氨酸(Threonine,T)分别点突变成缬氨酸(Valine,V)和亮氨酸(Leucine,L)。【结果】体外酶活实验结果显示,相对于MilA,MilA T102V对于CMP的催化活性下降87.1%,对于dCMP的催化活性没有影响;而MilA T102L均丧失了对于两种底物的活性。【结论】这表明Thr102对于MilA催化底物CMP形成HmCMP至关重要;同时,失去活性的仅比缬氨酸和野生型苏氨酸的链长多出了一个碳原子,暗示其在与底物结合时形成了一定的空间位阻效应。Thr在102位点的功能经过自然进化的微调有可能已经达到最优化。
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| 关 键 词： | 胞苷酸羟甲基化酶MilA 定点突变 脱氧胞苷酸羟甲基化酶 体外催化反应 |
Analysis of key amino acid involved in hydroxylation of methyl group of CMP in CMP hydroxymethylase MilA by site-directed mutagenesis |
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| GAO Tu-Ling,CHEN Cheng,ZHAO Gong,DENG Zi-Xin,HU Shen-Cai and HE Xin-Yi.Analysis of key amino acid involved in hydroxylation of methyl group of CMP in CMP hydroxymethylase MilA by site-directed mutagenesis[J].Microbiology,2014,41(1):50-57. |
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| Authors: | GAO Tu-Ling CHEN Cheng ZHAO Gong DENG Zi-Xin HU Shen-Cai and HE Xin-Yi |
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| Institution: | 1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan, Hubei 430023, China 2. State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China;2. State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China;2. State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China;2. State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China;1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan, Hubei 430023, China;2. State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | CMP hydroxymethylase Site-directed mutagenesis Deoxycytidylate hydroxymethylase In vitro catalytic reaction |
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