中国弯颈霉的培养性状和药理作用研究

中国弯颈霉ZN923菌株分离自蔗褐蠹蛾PhragmatoeciacastaneaeHubner虫尸。其生长最适温度为25～28℃,最适pH6～7,在富氮培养基上菌丝生长茂盛、洁白,有香气。药理试验表明,该菌株培养物具有镇静、抗炎、增强耐缺氧能力、扩张气管和雄性激素样作用,急性毒性试验以80g／kg（最大允许容积）剂量对小鼠一次灌胃,未见不良作用。中国弯颈霉是与冬虫夏草Cordycepssinensis（Berk．）Sacc．无性型密切相关的真菌。具有潜在的药用价值。     

KLF4过表达对RAW264.7巨噬细胞和C2C12肌原细胞增殖的影响

为探讨Krueppel样因子4（Krueppel-like factor 4,KLF4）过表达对Raw264．7巨噬细胞和C2C12小鼠肌原细胞生长的影响,采用脂质体转染KLF4的真核表达质粒于Raw264．7巨噬细胞和C2C12细胞中,G418筛选阳性克隆,Western blotting鉴定高表达克隆;观察各转染细胞生长情况,CCk-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期分布,凋亡百分率,发现与空质粒转染细胞相比,KLF4过表达对Raw264．7巨噬细胞的生长曲线、细胞周期分布、凋亡百分率没有明显的影响,而C2C12细胞生长速度减慢,细胞凋亡百分率明显高于空载体组,上述结果表明KLF4基因对Raw264．7巨噬细胞增殖没有明显影响,而对C2C12细胞增殖起负调控作用．     

采用蛋白质工程技术将αB-晶状体蛋白导入心肌细胞的初步研究

为将αB-晶状体蛋白（αB-crystallin, αB-C）导入心肌细胞,采用蛋白质工程技术将人αB-晶状体蛋白全长cDNA基因克隆至具有细胞膜通透能力的膜移位序列（membrane-translocating sequence,MTS）的碱基顺序的下游,在大肠杆菌中表达谷胱甘肽5-转移酶(GST)-MTS-αB-C融合蛋白.用谷胱甘肽-Sepharose4B亲和层析分离表达产物,用Xa因子将其中GST切除,并通过阴离子交换层析纯化MTS-αB-C.纯化的MTS-αB-C在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上呈单一条带,分子质量23 ku;免疫印迹显示GST-MTS-αB-C与MTS-αB-C均能为人αB-C抗体识别而在相应位置出现清晰条带.GST-MTS-αB-C与MTS-αB-C均有分子伴侣活性.用异硫氰荧光素（FITC）标记的MTS-αB-C与心肌细胞共培养后,在荧光显微镜下观察到其进入了心肌细胞.     

Mip1对大鼠心肌细胞凋亡基因Bid转录调控作用的初探

目的:研究转录因子Mip1对大鼠心肌细胞H9C2凋亡相关基因Bid的转录调控作用.方法:以H9C2细胞基因组DNA为模板,扩增Bid核心启动子片段,将其克隆入荧光素酶报告基因质粒PGL3-Basic中,构建重组载体,并采用双酶切法、PCR法及基因测序对其进行鉴定.用脂质体转染法将该载体转入Mip1不同程度过表达的H9C2细胞,检测该细胞Bid基因启动子区的转录活性.结果:成功克隆Bid基因启动子区,双酶切、PCR和基因测序均显示PGL3-Basic-Bid promoter重组载体构建成功.荧光素酶相对活性检测显示在H9C2细胞中,随着Mip1转入的增多,Bid启动子区转录活性逐渐下降.结论:Mip1作为一个新的转录抑制因子,可以下调凋亡基因Bid的转录.     

核定位信号在热休克蛋白 70 抑制氧化应激所致 细胞核仁分离中的作用

为探讨核定位信号在热休克蛋白 70 (HSP70) 抑制 H²O² 所致核仁损伤中的作用,采用分子克隆技术分别构建了 4 个真核表达载体, pcDNA3.1(-)-HSP70^WT (HSP70 野生型), pcDNA3.1(-)-HSP70^ΔNLS (核定位信号缺失突变体 ), pEGFP-N1-HSP70^WT, pEGFP-N1- HSP70^ΔNLS. 向传代培养的 C²C¹²肌源细胞培养液中加入终浓度为 1.0 mmol/L 的 H²O² 模拟体外氧化应激 . 甲苯胺蓝染色细胞核仁发现,正常细胞仅有一个位于中央的、浓染致密的核仁颗粒 . 过氧化氢处理后 3 h ,可见明显的核仁分离 . 热休克反应处理的细胞及转 pcDNA3.1( － )-HSP70WT 细胞则能明显抑制氧化应激所致的核仁分离 . 荧光蛋白示踪及核仁蛋白质免疫印迹分析显示, H²O²处理后 1 h , HSP70WT 由正常时的细胞浆定位转为细胞核及核仁定位,而 HSP70ΔNLS 在 H²O²处理后仍定位于细胞浆,同时丧失了抑制核仁分离的作用 . 上述结果提示,野生型 HSP70 能显著抑制氧化应激所致细胞核仁分离,核定位信号通过介导 HSP70 向细胞核及核仁移位而决定 HSP70 对核仁损伤的保护作用 .     

热休克因子1对内毒素所致G-CSF基因表达的影响

为探讨热休克因子1(heatshockfactor 1,HSF1)活化和过表达对内毒素(endotoxin ,ET)所致粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulatingfactor,G CSF)基因表达的影响,采用大肠杆菌内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)处理RAW2 6 4 7巨噬细胞,并通过热休克预处理诱导HSF1活化,采用Western印迹检测HSP70的表达观察HSF1的活化情况,RT PCR检测热休克反应(heatshockresponse ,HSR)对G CSFmRNA表达的影响;构建HSF1的pcDNA3 1真核表达质粒,采用脂质体转染法建立HSF1过表达RAW 2 6 4 7巨噬细胞株,用免疫细胞化学和Western印迹观察HSF1的表达,RT- PCR及Northern印迹进一步研究HSF1对G CSF基因表达的可能影响.发现LPS诱导巨噬细胞中G- CSFmRNA表达增多,并随时间的延长,表达量逐渐增加;与单纯内毒素处理组相比,热休克预处理后,LPS诱导的巨噬细胞G- CSFmRNA的表达明显被抑制;建立的稳定表达HSF1的RAW 2 6 4 7细胞株中有HSF1蛋白的核移位;HSF1过表达可明显抑制LPS诱导的RAW2 6 4 7巨噬细胞G -CSFmRNA的表达.上述结果表明热休克预处理能抑制LPS诱导的巨噬细胞G- CSFmRNA的表达;HSF1过表达可抑制内毒素诱导的巨噬细胞G CSFmRNA的表达.     

HSF1基因剔除对HSR抗内毒素血症的影响

利用内毒素(LPS)血症小鼠模型,观察HSF1基因剔除对热休克反应(HSR)保护作用的影响.采用腹腔注射LPS建立内毒素血症小鼠模型,HSR采用肛温42℃维持15 min,室温恢复24 h,利用RT-PCR、苏木素-伊红(HE)染色、丙二醛测定以及死亡率,计算和分析重要脏器组织中炎症介质基因的表达、脏器损伤程度及小鼠存活率.注射LPS 15mg/kg 72 h后HSR LPS(HSF1 / )组存活率(7/15)显著高于LPS(HSF1 / )组(0/15)、LPS(HSF1-/-)组(0/14)和HSR LPS(HSF1-/-)组(0/14),而注射LPS 14 mg/kg 72 h后,LPS(HSF1 / )组存活率(5/15)显著高于LPS(HSF1-/-)组(0/13)和HSR LPS(HSF1-/-)组(0/13).在注射LPS 12 h后LPS(HSF1 / )组、LPS(HSF1-/-)组和HSR LPS(HSF1-/-)组的心、肺组织丙二醛含量显著升高,但HSR LPS(HSF1 / )组不升高.肺组织炎症介质基因IL-IB、IL-6、TNF-α、CCL-2、SOCS3、MCSF、GCSF、IL-15在LPS(HSF1-/-)组和LPS(HSF1 / )组表达上调,HSR LPS(HSF1-/-)组除IL-15较低外其他上调更甚,HSR LPS(HSF1 / )组除IL-1β和TNF-α较高外其他显著下调.注射LPS后LPS(HSF1 / )组和LPS(HSF1-/-)组的肺、肝、肾病理形态改变明显,HSR LPS(HSF1 / )组改变较轻,HSR LPS(HSF1-/-)组改变更加严重.HSF1基因剔除能显著消减HSR对内毒素血症小鼠的保护作用.     

氯化钴对H9c2心肌细胞新基因Mipu1表达的影响

目的：研究氯化钴（CoCl2）对大鼠胚胎心脏来源的H9c2心肌细胞中新基因Mipu1表达的影响。方法：利用不同浓度的CoCl2（0、100、200、300、400、500μmol/L）处理H9c2细胞9h,及200μmol/L CoCl2处理H9c2细胞不同的时间（0、6、9、12、24h）后,用RT-PCR和Western Blot分别观察H9c2细胞Mipu1 mRNA和蛋白的表达情况。结果：CoCl2可以诱导H9c2细胞中Mipu1 mRNA和蛋白表达升高,200μM CoCl2处理组的Mipu1的表达水平高于100μM CoCl2处理组,但是更高浓度的CoCl2（〉200μM）不能使Mipu1的表达进一步升高。随着CoCl2作用时间的延长,Mipu1的表达逐步升高,在12h达到高峰,但是在24h后下降。结论：CoCl2能够促进H9c2细胞新基因Mipu1的表达,并且具有一定的剂量和时间依赖性。     

氯化钴对H9c2 心肌细胞新基因Mipu1 表达的影响

目的:研究氯化钴(CoCl2)对大鼠胚胎心脏来源的H9c2心肌细胞中新基因Mipu1表达的影响。方法:利用不同浓度的CoCl2(0、100、200、300、400、500μmol/L)处理H9c2细胞9h,及200μmol/L CoCl2处理H9c2细胞不同的时间(0、6、9、12、24h)后,用RT-PCR和Western Blot分别观察H9c2细胞Mipu1 mRNA和蛋白的表达情况。结果:CoCl2可以诱导H9c2细胞中Mipu1 mRNA和蛋白表达升高,200μM CoCl2处理组的Mipu1的表达水平高于100μM CoCl2处理组,但是更高浓度的CoCl2(>200μM)不能使Mipu1的表达进一步升高。随着CoCl2作用时间的延长,Mipu1的表达逐步升高,在12h达到高峰,但是在24h后下降。结论:CoCl2能够促进H9c2细胞新基因Mipu1的表达,并且具有一定的剂量和时间依赖性。