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通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+ )-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础.提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA.以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90ABl.将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经Nde I和Sal I双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆.挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+ )-hHsp90AB1.重组质粒转化Rosetta( DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13%.接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶素和层析,蛋白纯度达到98%. 相似文献
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用流式细胞术,Feulgen显微分光光度法,荧光显微分光光度法测定正常人精子核DNA相对含量:结果表明,上述方法所测得的精子核DNA相对含量稳定,变化范围小。同时用Feulgen显微分光光度法测定不育者精子核DNA相对含量。显示不育者精子核DNA相对含量高于正常人,提示精子核DNA核蛋白复合物异常可能是某些男性不育症的原因。此项研究为诊断男性不育症提供了新方法,在男性学精子核分子研究方面提供了依据。 相似文献
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以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒.酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子.重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100%相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带. 相似文献
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紫球藻胞外多糖抗柯萨奇B3病毒活性研究I 总被引:1,自引:0,他引:1
采用MTT法研究了紫球藻胞外磺酸化多糖(ESPS)的细胞毒性,在高浓度(250μg/ml)下尚未发现对HEp-2细胞有明显毒性。CPE抑制法发现ESPS能明显抑制细胞的CPE,在综合、预防、治疗和直接作用四种给药方式下都具有抑制CVB3的作用。直接作用法的活性最高,TI值高达1920.6,是阳性对照药病毒唑的31倍。ES-PS组分中分子量越大,抗病毒活性越高,其中分子量大于300k的组分,IC50可低至0.754μg/ml,TI值高达331.6,是病毒唑的5倍多。结果表明ESPS有强烈的抗CVEb病毒活性,作用机制可能是干扰病毒在细胞表面的吸附及侵染过程。 相似文献
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采用MTT法研究了紫球藻胞外磺酸化多糖(ESPS)的细胞毒性,在高浓度(250μg/mL)下尚未发现对HEp-2细胞有明显毒性.CPE抑制法发现ESPS能明显抑制细胞的CPE,在综合、预防、治疗和直接作用四种给药方式下都具有抑制CVB3的作用.直接作用法的活性最高,TI值高达1920.6,是阳性对照药病毒唑的31倍.ESPS组分中分子量越大,抗病毒活性越高,其中分子量大于300 k的组分,IC50可低至0.754μg/mL,TI值高达331.6,是病毒唑的5倍多.结果表明ESPS有强烈的抗CVB3病毒活性,作用机制可能是干扰病毒在细胞表面的吸附及侵染过程. 相似文献
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目的:构建穿膜肽KGF-2(TAT-KGF-2),研究其对人角质形成细胞HaCaT的增殖作用。方法:采用普通PCR技术和特殊引物从人胚胎肺成纤维细胞cDNA中扩增出目的基因TAT-KGF-2,并将其插入pET-28a(+)载体中构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒;将该质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白TAT-KGF-2;通过Ni-NTA柱纯化获得目标重组蛋白并利用Western blot进行鉴定;MTT法研究TAT-KGF-2对HaCa的增殖作用。结果:成功构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人KGF-2基因序列同源性达到100%;获得穿膜肽KGF-2蛋白,分子量约为19 kDa,纯度达到95%以上;TAT-KGF-2对HaCaT在12.5ng/ml时具有增殖作用,并呈浓度依赖性,而且与不具有穿膜功能的KGF-2相比有更强的增殖效果。结论:成功纯化出TAT-KGF-2蛋白,并验证其对HaCaT具有增殖作用,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。 相似文献