一种改进的烟草多酚氧化酶Ⅱ纯化方法

目的:选择不同的分离、纯化步骤并比对分析,筛选出纯化烟草中多酚氧化酶(PPO)的优化组合方案。方法:采用分段盐析、DEAE-SepharoseFastflow和SephadexG-150柱层析纯化PPO,通过测定和比较酶活性筛选最佳条件。结果:确定了最佳盐析浓度(40%)和柱层析条件,SDS-PAGE、FPLC以及动力学常数的检测结果表明,纯化出的蛋白质相对分子质量为42000,Km为1.2mmol/L,得到了纯化91倍的烟草多酚氧化酶Ⅱ。结论:优化方案减少了有机溶剂分级沉淀、阳离子交换层析等步骤,使纯化过程大大缩短。     

DREB1A类转录调控域中对转录激活功能起关键作用的氨基酸

从烟草品种k326中克隆到2个干旱应答元件结合蛋白类(DREB-Like)转录因子基因,命名为NtDREBI和NtDREB1A.序列分析发现,NtDREBI和NtDREB1A编码的蛋白质具有典型的AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚族A类特征.酵母单杂交结果显示,NtDREBI具有激活功能, 而NtDREB1A不能激活下游基因,但可以与DRE元件结合.将NtDREBI、NtDREB1A与其它AP2/EREBP类转录因子序列比对,发现在C末端第148位氨基酸有显著差别.采用定点突变方法进一步研究表明,DREB1A类转录因子的第148位氨基酸残基与其邻近氨基酸残基的相互作用对调控转录激活功能起关键作用.     

烟草DREBP转录因子结合DRE元件的关键氨基酸

从烟草品种本塞母氏中分离出2条DREB类转录因子基因,分别命名为NbDREB1和 NbDREB2.根据测序结果推导出的氨基酸序列分析显示,NbDREB1和NbDREB2都具有典型的AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚族A类特征.酵母单杂交结果显示,它们都不具有激活功能.连接pGADT7反式激活载体形成融合基因表达结果显示,NbDREB1能与DRE顺式作用元件结合,NbDREB2则不能.比较NbDREB1和NbDREB2的AP2区,发现两者的第2和49位氨基酸残基不同.对NbDREB2的第2位氨基酸残基N点突变为Y,NbDREB2也显示出与DRE顺式元件结合的活性,表明烟草DREB转录因子的AP2区第2位氨基酸残基Y是识别及结合DRE顺式作用元件必需的氨基酸残基.     

转反义trxs基因对小麦种子萌发过程中淀粉水解酶的影响

检测转反义trxs基因小麦种子萌发过程中胚乳内α-淀粉酶、β-淀粉酶和支链淀粉酶活性变化的结果表明,在种子萌发4d内,转基因小麦3种酶的活性态酶活性均低于野生型小麦,而3种酶的抑制态酶活性则均高于野生型小麦,转基因小麦淀粉酶的抑制程度高于野生型小麦,这可能是转基因小麦酶活性降低的原因之一。     

转反义硫氧还蛋白基因小麦萌发种子中蛋白质的变化

硫氧还蛋白h（thioredoxin h,Trx h）是一类广泛存在于生物体内的多功能活性蛋白,分子量约为12kD,它通过还原靶蛋白中的二硫键参与酶活性调节、抗胁迫、信号传导等许多重要的生命活动。硫氧还蛋白h能促进谷物类种子萌发过程,主要表现在以下2个方面：（1）在籽粒萌发期间,硫氧还蛋白可通过还原储存蛋白的分子内二硫键使其更易于被降解;（2）硫氧还蛋白也可以直接地通过将酶还原或者间接地通过使酶抑制蛋白失活而激活酶。源于Phalaris coerulescens的trxs基因（thioredoxin s,trxs）与小麦硫氧还蛋白h基因（thioredoxin h,trx h）同属于硫氧还蛋白基因家族,它们的cDNA有94％的同源性,表达产物也有相似的生物功能。我们采用基因枪法将反义trxs基因导入小麦,获得了可稳定遗传的小麦,并检测出转基因种子中硫氧还蛋白h表达量、水溶蛋白和醇溶蛋白的还原状态以及α-淀粉酶活性均低于对照小麦;另外,通过模拟降雨抗穗发芽试验证实转基因株系具有很强的抗穗发芽能力。以转反义trxs基因抗穗发芽小麦为材料,检测反义trxs基因小麦籽粒萌发过程中蛋白质的变化,探讨转反义trxs基因小麦的抗穗发芽机理。研究表明反义trxs基因能够减缓KCl可溶性蛋白中Chloroform-methanol（CM）蛋白向代谢类蛋白的转化进程,在萌发初期降低籽粒代谢类蛋白的含量,使籽粒代谢速度下降,而CM蛋白主要包含一些分子量小于20kD的蛋白质。在籽粒成熟过程中,硫氧还蛋白能够阻止麦谷蛋白亚基形成谷蛋白聚合体的过程,在转基因小麦中麦谷蛋白更易于形成大分子量的谷蛋白大聚合体,使得转基因小麦中的谷蛋白在萌发初期更难于被水解,因此转基因小麦籽粒会因谷蛋白难于降解而萌发较慢。另外,反义trxs基因减慢了麦胚中10kD蛋白的降解过程。     

转反义Trx s基因小麦灌浆期间籽粒和成熟后种子萌发期间的过氧化物酶和过氧化氢酶活性变化

检测转反义Trx s基因小麦灌浆期间籽粒和萌发期种子中过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性及其同工酶变化的结果表明,在籽粒成熟过程中,转基因小麦籽粒中POD和CAT活性均低于非转基因小麦:在小麦种子萌发过程中,转基因小麦种子中的POD和CAT活性也均低于非转基因小麦.