反义trxs基因导入对小麦籽粒脱支酶活性的影响

以转反义硫氧还蛋白基因株系01TY34-73-9及其对照品种‘豫麦34’为材料,运用PCR检测和酶活性测定的方法,对转基因株系遗传稳定性以及转基因与对照种子中脱支酶活性进行测定。结果显示:(1)外源基因已经稳定遗传至后代;(2)转基因种子在不同成熟时期和不同萌发过程中的脱支酶活性与对照相比均有不同程度的降低平均降低10.3%,但仅花后25 d到收获后5 d脱支酶活性显著低于对照,其中最低值出现在花后30 d,平均比对照下降了12.0%;(3)在花后30 d和后熟5 d萌发过程中,转基因种子脱支酶活性始终低于对照,平均下降6.2%和22.2%。表明反义trxs基因的导入干扰了小麦trxh基因的表达,使trxh转录量减少,小麦籽粒中脱支酶的活性受抑。     

转反义trxs基因对小麦种子萌发过程中淀粉水解酶的影响

检测转反义trxs基因小麦种子萌发过程中胚乳内α-淀粉酶、β-淀粉酶和支链淀粉酶活性变化的结果表明,在种子萌发4d内,转基因小麦3种酶的活性态酶活性均低于野生型小麦,而3种酶的抑制态酶活性则均高于野生型小麦,转基因小麦淀粉酶的抑制程度高于野生型小麦,这可能是转基因小麦酶活性降低的原因之一。     

转反义硫氧还蛋白基因小麦萌发种子中蛋白质的变化

硫氧还蛋白h（thioredoxin h,Trx h）是一类广泛存在于生物体内的多功能活性蛋白,分子量约为12kD,它通过还原靶蛋白中的二硫键参与酶活性调节、抗胁迫、信号传导等许多重要的生命活动。硫氧还蛋白h能促进谷物类种子萌发过程,主要表现在以下2个方面：（1）在籽粒萌发期间,硫氧还蛋白可通过还原储存蛋白的分子内二硫键使其更易于被降解;（2）硫氧还蛋白也可以直接地通过将酶还原或者间接地通过使酶抑制蛋白失活而激活酶。源于Phalaris coerulescens的trxs基因（thioredoxin s,trxs）与小麦硫氧还蛋白h基因（thioredoxin h,trx h）同属于硫氧还蛋白基因家族,它们的cDNA有94％的同源性,表达产物也有相似的生物功能。我们采用基因枪法将反义trxs基因导入小麦,获得了可稳定遗传的小麦,并检测出转基因种子中硫氧还蛋白h表达量、水溶蛋白和醇溶蛋白的还原状态以及α-淀粉酶活性均低于对照小麦;另外,通过模拟降雨抗穗发芽试验证实转基因株系具有很强的抗穗发芽能力。以转反义trxs基因抗穗发芽小麦为材料,检测反义trxs基因小麦籽粒萌发过程中蛋白质的变化,探讨转反义trxs基因小麦的抗穗发芽机理。研究表明反义trxs基因能够减缓KCl可溶性蛋白中Chloroform-methanol（CM）蛋白向代谢类蛋白的转化进程,在萌发初期降低籽粒代谢类蛋白的含量,使籽粒代谢速度下降,而CM蛋白主要包含一些分子量小于20kD的蛋白质。在籽粒成熟过程中,硫氧还蛋白能够阻止麦谷蛋白亚基形成谷蛋白聚合体的过程,在转基因小麦中麦谷蛋白更易于形成大分子量的谷蛋白大聚合体,使得转基因小麦中的谷蛋白在萌发初期更难于被水解,因此转基因小麦籽粒会因谷蛋白难于降解而萌发较慢。另外,反义trxs基因减慢了麦胚中10kD蛋白的降解过程。