茄科作物青枯菌NADH脱氢酶F亚基在细胞运动和致病性中的功能研究

[目的]劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）在茄科作物上引起严重的细菌性青枯病,本研究旨在发掘青枯劳尔氏菌与致病相关的基因。[方法]利用Tn5转座子构建随机插入突变体,分析生物膜形成、细胞运动和致病性;对有表型变化的突变体,运用TAIL-PCR方法鉴定Tn5插入位点,确定所突变的基因。[结果]以模式菌株GMI000为出发菌,总共获得了400个突变体,其中2个突变体不能形成生物膜,在软琼脂平板上的运动能力下降;接种感病番茄植物,这2个突变体都不能引起萎焉症状。TAIL-PCR结果显示,2个突变体的Tn5插入位点都在NADH脱氢酶F亚基（nuoF）中,距离翻译起始位点分别为103-bp和225-bp。ripAY基因启动子推动的nuoF基因互补载体,完全恢复了2个突变体的表型。[结论]NADH脱氢酶复合物是微生物呼吸电子传递链中的第一步催化酶。我们的结果表明,NADH脱氢酶复合物对R.solanacearum生物膜形成、细胞运动和致病性也有重要作用。     

hrpD6基因决定白叶枯病菌在烟草上的过敏反应和在水稻上的致病性

【目的】白叶枯病菌hrp基因簇由包括hrpD6在内的26个hpa-hrp-hrc基因组成,与植物互作后形成Ⅲ型分泌系统(T3S),将T3S效应分子注入寄主细胞中从而决定在非寄主上的过敏反应(HR)和在水稻上的致病性。但hrpD6基因是否参与了白叶枯病菌在非寄主上的过敏反应(HR)和在水稻上的致病性(pathogenicity)还不清楚。【方法】借助同源重组方法,本研究对白叶枯病菌hrpD6基因进行了突变。【结果】PCR和Southern杂交结果显示,hrpD6基因被成功敲除。烟草上测定结果显示,hrpD6突变体ΔPhrpD6丧失了HR激发能力。致病性测定发现,ΔPhrpD6在水稻苗期不能形成水渍症状,在成株期水稻上不具有致病性,并且细菌生长能力显著下降。功能互补结果显示,hrpD6基因可恢复ΔPhrpD6在烟草上激发HR和在水稻上的致病性以及在水稻组织中的生长能力。RT-PCR结果显示,hrpD6基因的转录表达不仅受水稻诱导,而且受hrpG和hrpX基因调控。不仅如此,hrpD6基因突变还影响T3S效应分子hpa1基因的转录表达和Hpa1蛋白的分泌,暗示hrpD6基因对hpa1基因转录表达具有调控作用。【结论】hrpD6基因的缺失导致白叶枯病菌不能激发烟草产生HR和和丧失在水稻上的致病性,主要是HrpD6对hpa1基因转录表达具有调控作用,并影响T3S效应分子Hpa1的分泌。这些结果为进一步分析hrpD6是否参与T3S分泌装置的形成和调控其它hrp基因的转录表达从而决定病菌在非寄主上的HR和在水稻上的致病性,提供了科学线索。     

水稻黄单胞菌黄色素合成相关基因的克隆与鉴定

用硫酸二乙酯(DES)诱变水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)和条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, 简称Xooc),分别得到5株和13株黄色素缺失突变体,其中来自Xooc的M6和M12 还丧失了对水稻的致病性和在烟草上激发过敏反应的能力。以Xooc黄色素缺失突变体M51为受体菌交叉互补从Xoo JXOIII基因文库中筛选出一个黄色素合成相关的基因克隆pA341,以Xoo黄色素缺失突变体M1071为受体菌,从Xooc RS105基因文库中获得了一个黄色素合成相关的基因克隆pA270。功能互补显示,18株黄色素缺失突变体中的10株能分别被pA341和 pA270互补后正常产生黄色素,但这两个克隆不能同时互补同一株黄色素缺失突变体。能被pA341互补的黄色素缺失突变体M6没有恢复对水稻的致病性和在烟草上激发过敏反应,表明黄色素合成相关基因与hrp基因间不存在相关性。斑点杂交结果表明,pA270与pA341之间没有同源性。pA270亚克隆结果显示,与黄色素合成相关的基因约11.6kb大小,以基因簇的形式存在,不仅决定了黄色素的产生,还影响黄色素合成的数量和质量（吸收峰）。在紫外光条件下,黄色素能够提高菌体的存活率,提示黄色素对病原细菌有保护作用。     

茄科作物青枯菌NADH脱氢酶F亚基在细胞运动和致病性中的功能研究（英文）

【目的】劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)在茄科作物上引起严重的细菌性青枯病,本研究旨在发掘青枯劳尔氏菌与致病相关的基因。【方法】利用Tn5转座子构建随机插入突变体,分析生物膜形成、细胞运动和致病性;对有表型变化的突变体,运用TAIL-PCR方法鉴定Tn5插入位点,确定所突变的基因。【结果】以模式菌株GMI000为出发菌,总共获得了400个突变体,其中2个突变体不能形成生物膜,在软琼脂平板上的运动能力下降;接种感病番茄植物,这2个突变体都不能引起萎焉症状。TAIL-PCR结果显示,2个突变体的Tn5插入位点都在NADH脱氢酶F亚基(nuoF)中,距离翻译起始位点分别为103-bp和225-bp。ripAY基因启动子推动的nuoF基因互补载体,完全恢复了2个突变体的表型。【结论】NADH脱氢酶复合物是微生物呼吸电子传递链中的第一步催化酶。我们的结果表明,NADH脱氢酶复合物对R. solanacearum生物膜形成、细胞运动和致病性也有重要作用。     

用于植物病原细菌标记的pBB-GFP载体构建及应用

扩增青枯劳尔氏菌RipAK基因启动子序列,与lacZ基因融合得到p HM1:P_(RiPAK)LacZ。携带pHM1:P_(RiPAK)LacZ的青枯劳尔氏菌在营养丰富和基本培养基中都有LacZ活性,表明RipAK启动子可以推动lacZ基因的表达。为构建用于标记植物病原细菌的绿色荧光表达载体,把RipAK启动子和gfp基因克隆到质粒pBBR1MCS-5,使得gfp基因在RipAK启动子的驱动下表达;构建的表达载体pBB-GFP在大肠杆菌中即可表达绿色荧光蛋白。pBB-GFP载体能有效标记青枯劳尔氏菌、番茄细菌性斑点病菌和柑橘溃疡病菌,在荧光显微镜下观察到3种植物病原细菌呈短杆状,青枯劳尔氏菌还可形成多个菌体串联的线状结构。荧光标记对3种病原菌在寄主植物上的致病力没有影响,将标记菌株分别滴加在寄主植物叶片的创伤处,可观察到大量的绿色荧光聚集。本研究构建的pBB-GFP载体能用于多种植物病原细菌的绿色荧光标记,标记后的病原细菌在液体培养及侵染寄主植物过程中都能观察到荧光。     

用于植物病原细菌标记的pBB-GFP载体构建及应用北大核心CSCD

扩增青枯劳尔氏菌RipAK基因启动子序列,与lacZ基因融合得到p HM1:P_(RiPAK)LacZ。携带pHM1:P_(RiPAK)LacZ的青枯劳尔氏菌在营养丰富和基本培养基中都有LacZ活性,表明RipAK启动子可以推动lacZ基因的表达。为构建用于标记植物病原细菌的绿色荧光表达载体,把RipAK启动子和gfp基因克隆到质粒pBBR1MCS-5,使得gfp基因在RipAK启动子的驱动下表达;构建的表达载体pBB-GFP在大肠杆菌中即可表达绿色荧光蛋白。pBB-GFP载体能有效标记青枯劳尔氏菌、番茄细菌性斑点病菌和柑橘溃疡病菌,在荧光显微镜下观察到3种植物病原细菌呈短杆状,青枯劳尔氏菌还可形成多个菌体串联的线状结构。荧光标记对3种病原菌在寄主植物上的致病力没有影响,将标记菌株分别滴加在寄主植物叶片的创伤处,可观察到大量的绿色荧光聚集。本研究构建的pBB-GFP载体能用于多种植物病原细菌的绿色荧光标记,标记后的病原细菌在液体培养及侵染寄主植物过程中都能观察到荧光。     

苜蓿中华根瘤菌nifA基因突变影响多种细胞学过程

苜蓿中华根瘤菌nifA基因在共生固氮过程中担负着调控功能,nifA突变株Rm1354在宿主植物的根部诱导白色无效根瘤。本文报道Rm1354在自生状态下的表型变化。nifA的突变导致根瘤菌在半固体培养基上泳动变慢,胞外蛋白含量降低。有趣的是,Rm1354在延宕期间高丝氨酸内酯含量比野生型低,在指数期和静止期却比野生型高。另外,突变株Rm1354的竞争结瘤能力也大大减弱。这些结果揭示了苜蓿中华根瘤菌nifA基因对许多细胞学过程都有调控作用。     

柑橘溃疡病菌II型分泌通道基因xpsD突变体的鉴定及功能分析

【目的】鉴定柑橘溃疡病菌胞外水解酶减弱突变体Mxac56-20的Tn5插入位点,及其在柑橘上的致病力。【方法】采用质粒拯救方法获得Tn5旁侧序列,与基因组信息比对后明确突变体的插入位点;构建功能互补载体对突变体进行功能互补,检测互补菌株胞外蛋白水解酶、纤维素酶和淀粉酶的恢复情况;在寄主植物柑橘上观察致病力变化。【结果】Mxac56-20的Tn5插入位点是II型分泌系统xpsD基因,所构建的互补载体使突变体的胞外水解酶活性和致病力得到恢复。【结论】柑橘溃疡病菌xpsD基因的突变,导致胞外水解酶活性降低,在寄主上的致病力减弱,说明柑橘溃疡病菌的II型分泌系统在与寄主互作过程中起到致病因子的作用。     

水稻条斑病菌hrcC、hpa3和hrpE基因表达不依赖hrpG和hrpX基因调控

摘要：【目的】决定水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）在非寄主植物上激发过敏反应（hypersensitive response, HR）和在寄主水稻上致病性（pathogenicity）的hrp基因簇是受hrpG和hrpX基因调控的,但还不清楚hrpG和hrpX基因是否共同决定着所有hrp基因的表达。【方法】本文通过基因敲除方式获得了水稻条斑病菌的hrpG和hrpX基因的双突变体。【结果】烟草和水稻上测定结果显示,双突变体与单突变体一样,均在烟草上失去HR激发能力和丧失在水稻上的致病性;相应地,功能互补后双突变体恢复至野生表型。细菌在水稻悬浮细胞、hrp诱导培养基XOM3和营养丰富的培养基NB中生长后的RT-PCR结果显示,NB中hrp基因低水平表达,XOM3和水稻细胞能够高水平诱导hrp基因表达。无论何种生长条件,hrpG单突变体中hrcC、hrcT、hpa3和hrpE基因表达,而hpa1、hpa2、hpaB、hrcJ和hrpG基因不表达;hrpX单突变体中hpa2、hrcC、hpa3、hrpE和hrpG基因表达,而hpa1、hrcT、hpaB和hrcJ基因不表达;hrpG和hrpX双突变体中hrcC、hpa3和hrpE基因表达,而hpa1、hpa2、hpaB、hrcT、hrcJ和hrpG基因不表达。【结论】这提示,水稻条斑病菌的hrcC、hrpE和hpa3基因不受hrpG和hrpX基因单独或同时调控,而hrcT基因受HrpG调控。由此推测,水稻条斑病菌III型分泌系统关键组份的表达有可能通过另外的信号途径进行调控,这为进一步分析III型分泌途经的形成提供了线索。