一株具有防病促生功能的贝莱斯芽孢杆菌SF327

【目的】筛选植物根际促生贝莱斯芽孢杆菌,分析菌株的生防潜力和全基因组特征。【方法】通过温室小青菜促生试验以及植物益生表型的分析,明确具有促生功能的菌株SF327。用滤纸片法测定菌株SF327对5种植物病原真菌以及4种植物病原细菌的拮抗活性。通过大田喷雾接种的方式评价菌株SF327对水稻白叶枯病的防治潜力。利用antiSMASH分析预测菌株SF327产生的二次代谢产物。通过比较基因组分析SF327与2株植物根际益生贝莱斯芽孢杆菌的代表性菌株FZB42和SQR9的亲缘关系、核心基因以及二次代谢产物合成基因簇。【结果】菌株SF327能够产生生长素吲哚-3-乙酸,是一株有益的根围促生菌;对稻瘟病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉菌、橡胶树胶孢炭疽菌、尖孢炭疽病菌都具有明显的拮抗作用;也具有防治水稻白叶枯病的生防潜力。菌株SF327基因组全长4.08 Mb,GC含量为46.49%,共编码4 033个基因,含有13个潜在的次生代谢产物编码基因簇,不含有质粒。SF327与FZB42和SQR9具有较近的亲缘关系,有87%以上的核心基因相同,但与SQR9的亲缘关系较近。【结论】B. velezensis SF327是一株具有宽广拮抗谱的多功能菌株,具有较好的生防应用潜力。     

hrpD6基因决定白叶枯病菌在烟草上的过敏反应和在水稻上的致病性

【目的】白叶枯病菌hrp基因簇由包括hrpD6在内的26个hpa-hrp-hrc基因组成,与植物互作后形成Ⅲ型分泌系统(T3S),将T3S效应分子注入寄主细胞中从而决定在非寄主上的过敏反应(HR)和在水稻上的致病性。但hrpD6基因是否参与了白叶枯病菌在非寄主上的过敏反应(HR)和在水稻上的致病性(pathogenicity)还不清楚。【方法】借助同源重组方法,本研究对白叶枯病菌hrpD6基因进行了突变。【结果】PCR和Southern杂交结果显示,hrpD6基因被成功敲除。烟草上测定结果显示,hrpD6突变体ΔPhrpD6丧失了HR激发能力。致病性测定发现,ΔPhrpD6在水稻苗期不能形成水渍症状,在成株期水稻上不具有致病性,并且细菌生长能力显著下降。功能互补结果显示,hrpD6基因可恢复ΔPhrpD6在烟草上激发HR和在水稻上的致病性以及在水稻组织中的生长能力。RT-PCR结果显示,hrpD6基因的转录表达不仅受水稻诱导,而且受hrpG和hrpX基因调控。不仅如此,hrpD6基因突变还影响T3S效应分子hpa1基因的转录表达和Hpa1蛋白的分泌,暗示hrpD6基因对hpa1基因转录表达具有调控作用。【结论】hrpD6基因的缺失导致白叶枯病菌不能激发烟草产生HR和和丧失在水稻上的致病性,主要是HrpD6对hpa1基因转录表达具有调控作用,并影响T3S效应分子Hpa1的分泌。这些结果为进一步分析hrpD6是否参与T3S分泌装置的形成和调控其它hrp基因的转录表达从而决定病菌在非寄主上的HR和在水稻上的致病性,提供了科学线索。     

水稻条斑病细菌hrp基因诱导表达系统的建立

水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)决定在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response)和在寄主水稻上具致病性(pathogenicity)的hrp基因簇是诱导表达的。为研究hrp基因的功能,利用hpa1和hrpX基因的启动子与gfp基因进行融合,构建了hrp基因诱导表达系统。绿色荧光蛋白表达揭示,Xooc的hrp基因在营养丰富的NB培养基上不能有效表达,在hrp诱导培养基XOM3上可有效表达。以hrpX和hrpG突变体为参照,RT-PCR研究结果提示,Xooc野生型菌株hpa1基因在NB上不能有效表达,在XOM3培养基上可有效表达。相应地,hrpX突变体中hpa1基因不能被诱导表达,而在hrpG突变体中hpa1基因转录表达水平低于野生菌。研究结果还证实,水稻悬浮细胞能高效诱导Xooc的hrp基因表达。Xooc hrp基因诱导表达系统的建立为研究hrp基因功能、发掘T3SS效应分子以及开展Xooc致病性研究奠定了基础。     

水稻黄单胞菌黄色素合成相关基因的克隆与鉴定

用硫酸二乙酯(DES)诱变水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)和条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, 简称Xooc),分别得到5株和13株黄色素缺失突变体,其中来自Xooc的M6和M12 还丧失了对水稻的致病性和在烟草上激发过敏反应的能力。以Xooc黄色素缺失突变体M51为受体菌交叉互补从Xoo JXOIII基因文库中筛选出一个黄色素合成相关的基因克隆pA341,以Xoo黄色素缺失突变体M1071为受体菌,从Xooc RS105基因文库中获得了一个黄色素合成相关的基因克隆pA270。功能互补显示,18株黄色素缺失突变体中的10株能分别被pA341和 pA270互补后正常产生黄色素,但这两个克隆不能同时互补同一株黄色素缺失突变体。能被pA341互补的黄色素缺失突变体M6没有恢复对水稻的致病性和在烟草上激发过敏反应,表明黄色素合成相关基因与hrp基因间不存在相关性。斑点杂交结果表明,pA270与pA341之间没有同源性。pA270亚克隆结果显示,与黄色素合成相关的基因约11.6kb大小,以基因簇的形式存在,不仅决定了黄色素的产生,还影响黄色素合成的数量和质量（吸收峰）。在紫外光条件下,黄色素能够提高菌体的存活率,提示黄色素对病原细菌有保护作用。     

植物非寄主抗性

本综述从植物 微生物互作出发 ,对决定植物非寄主抗性的遗传基础和信号传导途径进行了分析 ,提出了利用植物非寄主抗性的可能途径。     

一株拮抗黄单胞菌的贝莱斯芽孢杆菌的分离和鉴定

【目的】为了筛选防治水稻条斑病(bacterial leaf streak,BLS)的生防细菌。【方法】以水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)的模式菌株RS105为靶标菌,采用平板稀释和抑菌圈法,从空心菜根际土壤中筛选到一株对RS105具有拮抗作用的细菌菌株504。通过形态学、生理生化特征以及16SrDNA和gyrA序列分析对菌株504进行了鉴定。利用牛津杯法测定504对植物病原黄单胞菌的拮抗活性及其无菌发酵液拮抗活性的稳定性。通过PCR扩增预测504编码合成脂肽类和聚酮类化合物的合成相关基因。采用苗期水稻注射接菌法来评价水稻组织中504对Xoc的拮抗活性。【结果】菌株鉴定结果表明504为贝莱斯芽孢杆菌,命名为Bacillusvelezensis504。抑菌实验显示,B.velezensis504对黄单胞菌属的细菌具有较好的抑菌活性,对水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae,Xoo)的拮抗效果最显著。基因预测结果显示,B. velezensis 504含有fenA、dhbA、sfrA、bmyA、beaS、dfnA及bacA等编码脂肽类和聚酮糖类抑菌化合物的基因簇。其无菌发酵液的活性物质耐高温和蛋白酶降解,但不耐强酸、强碱,在pH值为5.5–8.9时仍具有稳定的拮抗活性。在高感水稻品种原丰早上,B. velezensis 504对Xoc在水稻叶片中引起的水渍症状具有显著的抑制作用。【结论】B. velezensis 504能够特异性拮抗黄单胞菌,在黄单胞菌引起的细菌性病害的生物防治中将具有较大的应用潜力。     

大豆斑疹病菌harpin编码基因的克隆与特性研究

根据黄单胞菌harpin编码基因的同源性,设计简并引物,采用PCR方法从大豆斑疹病菌（Xanthomonas axonopodis pv.glycines, Xag）中克隆了402 bp的[STBX]hpa1[STBZ]同源基因,构建于表达载体pET30(a)上经转化大肠杆菌BL21菌株,获得基因工程菌BHR_3。基因工程菌诱导表达后经收集菌体和破碎细胞,得到表达产物为151kD的蛋白质。该蛋白质富含甘氨酸,不含半胱氨酸,对热稳定,对蛋白酶K敏感,可在非寄主烟草上激发过敏反应。激发的过敏反应需要植物体内水杨酸的积累,还可被真核生物代谢抑制剂抑制。序列比较显示,该基因与Xag中hpaG基因相同,与其它黄单胞菌中的hpa1基因有51.4%～93.8%的同源性,与其它革兰氏阴性植物病原细菌的harpin编码基因无同源性。据此把该基因产物鉴定为harpinXag。黄单胞菌harpin蛋白质序列比较发现,GG_GGG基序的多少并不是harpin蛋白的唯一特性。这为利用harpin蛋白开展植物病害控制的基因药物学设计提供了科学线索。     

水稻条斑病菌pilT基因在致病性中的功能分析

【目的】本实验室前期研究发现水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)RS105菌株中pil T基因Tn5转座子插入突变体在寄主水稻上致病性明显降低,在非寄主烟草上激发过敏反应(hypersensitive response,HR)的能力也明显减弱。为了揭示pilT基因在Xoc菌株中的功能,本文进行了深入研究。【方法】本实验通过无标记双交换敲除的方法获得Xoc RS105菌株pil T基因缺失突变体RΔpilT,并对该突变体的游动性以及生物膜等表型进行了检测。【结果】与野生型RS105菌株相比,敲除突变体RΔpilT不仅在感病水稻IR24上的致病性显著降低,在非寄主烟草上产生过敏反应的能力减弱,而且突变体游动性降低,生物膜含量增加,互补子能够恢复上述缺陷至野生型水平。qRT-PCR结果显示,在RΔpil T中,hrpG、hrpX、hrcC、clp、rpfG、pilA、pilC基因表达量明显降低。【结论】Xoc中pilT为重要的毒性相关基因,其致病性与游动性和生物膜含量变化相关,并且受clp、rpfG、pilA、pilC等基因调控。pil T基因编码的Pil T蛋白是构成IV型菌毛的亚基之一,为菌体运动提供能量。本文对pilT基因的功能研究,为进一步分析IV型菌毛在Xoc中的功能提供了线索。     

植物病原细菌毒性调控网络的研究进展

植物病原细菌通过复杂和精细的全局性调控网络来协调多个层面的毒性决定因子。在不同的植物病原细菌中,这些全局性的毒性调控网络控制着细菌的侵染策略、存活以及在面临寄主植物防卫系统的互作环境中实现成功侵染的病程。本文详细分析了植物病原细菌4个重要属(假单胞菌属、果胶杆菌属、黄单胞菌属和雷尔氏菌属)的模式病原菌主要的毒性调控系统,包括群体感应系统、双组分调控系统、转录激活调控子以及转录后、翻译后的调控机制。在此基础上,重点评价了一些模式菌株全局性毒性调控机制的异同点,总结了一些最新的研究进展,并绘制了精细的网络调控图。这些分析表明,虽然一些相同的调控系统控制着病原菌的毒性,但是在不同种以及种下的亚种或者致病变种中这些调控机制功能各异,对于病原菌全毒性的贡献也存在着明显的差异。