黄孢原毛平革菌抗营养阻遏产漆酶诱变育种及其产酶特性

【目的】筛选能抗营养阻遏产漆酶的黄孢原毛平革菌,论证其产漆酶的确定性及抗营养阻遏产木质素酶的可行性,为白腐菌产酶代谢调控、木质素降解机理的研究奠定基础。【方法】利用重复紫外诱变法,以愈创木酚富氮鉴别培养基筛选目标菌株;比较不同营养条件下菌体生长与产酶动力学差异研究产酶营养调控机理;通过热处理、排除锰离子和加入过氧化氢酶等不同措施论证黄孢原平毛平革菌能否产生漆酶。【结果】3种不同方法均证实选育到的pcR5305和pcR5324菌株在限氮与富氮条件下均能产生漆酶,pcR5305和pcR5324在限氮条件下产漆酶分别达到203.5、187.6 U/L;在富氮条件下为220.6、183.9 U/L,而原菌株pc530在两种条件下都基本不产生漆酶。二菌株产漆酶调控方式不同,pcR5305漆酶产生与菌体生长同步,而pcR5324漆酶产生却受营养氮阻遏。二菌株同时具有抗营养阻遏高产木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)(分别为LiP 1343.2、MnP 252.2 U/L;LiP 1169.5、MnP 172.4 U/L)的能力。【结论】筛选到的黄孢原毛平革菌变异菌株能产漆酶,同时表现了抗营养阻遏产漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的能力,具有重要的生产应用与理论研究价值,为白腐菌产酶代谢调控机理研究提供了原始菌株并奠定了良好的基础。     

利用科研课题提高基因工程教学质量

将科研融入课堂是高校提高基因工程课程教学质量最为重要的途径,而科研课题在基因工程课堂教学中对学生思维的启发、对教学内容的补充、对教学手段的优化以及对学生创新能力、科研能力的培养都具有非常积极的作用。文章分别对这些作用进行了探讨,希望今后能在此基础上不断探索并有效发挥其在基因工程教学质量提高中的作用。     

黄孢原毛平革菌突变株抗碳氮营养阻遏产漆酶碳氮生理调控机理

【目的】通过比较不同碳氮营养及其消耗对产漆酶的影响,了解白腐菌模式种黄孢原毛平革菌解除营养阻遏产漆酶代谢的生理生态特性,揭示白腐菌合成漆酶的碳氮生理调控机理。【方法】分别利用限碳限氮(CL-NL)、限碳富氮(CL-NS)、富碳限氮(CS-NL)与富碳富氮(CS-NS)4种条件培养黄孢原毛平革菌野生型(WT)与突变株,比较两者产漆酶动力学、菌体生长、葡萄糖与氨氮消耗差异及其相关性来揭示解除营养阻遏产漆酶调控生理特性,明确C、N营养对产漆酶的生理调控途径。【结果】突变菌株除消耗速率比野生型略慢外,两者氨消耗趋势一致,但对葡萄糖的消耗比野生型快且氨氮浓度对葡萄糖的消耗影响不大。在CL-NL、CL-NS、CS-NL、CS-NS 4种培养条件下,野生型分别在培养后期的第11、14、19和19天的次生代谢时期产生0.107、0.029、12.84和18.05U/L漆酶,启动漆酶合成及酶峰值出现的时间与基质中葡萄糖耗尽或接近耗尽的时刻,或同氨氮消耗至最低值的时刻相对应;与WT产漆酶特性不同,突变株产漆酶伴随整个培养过程且均有两个产酶高峰,分别在培养的第8、7、12天和12天出现298.83、343.14、271.22、251.49U/L漆酶第一个产酶高峰,在培养的第12、13、19和19天产生257.69、298.78、213.81、216.93U/L漆酶的第二个产酶高峰。碳氮营养对产酶的影响显示:两菌株只要初始碳源浓度相同(限碳或富碳),各自产酶动力学趋势基本一致;相反,即使初始氮源浓度相同但其产酶动力学趋势却不同,说明碳源对黄孢原毛平革菌产漆酶的影响比氮源更为重要。【结论】野生型黄孢原毛平革菌产漆酶受碳或氮饥饿调控,碳、氮各自独立发挥作用且在不同的营养条件下由不同营养素所调控,如在限碳条件下产漆酶主要由葡萄糖饥饿启动,而在富碳条件下则由氨氮饥饿所激发,以碳或氮菌体负荷表示是否达到启动酶合成的调控阀值比单纯碳或氮浓度更为合理。突变菌株漆酶合成的启动不受碳、氮营养所阻遏,可能涉及一个全局调控的改变,解除了漆酶合成的营养阻碍。     

一氧化氮在启动黄孢原毛平革菌木质素降解酶合成中的作用

[目的]通过了解一氧化氮在启动黄孢原毛平革菌合成木质素过氧化物酶(LiP)中的作用及其作用机制,弄清白腐菌启动次生代谢的调控机制.[方法]以黄孢原毛平革菌原种pc530及突变种pcR5305为研究对象,弄清在不同营养条件下NO含量的动态变化及其与合成LiP之间的关系,再通过添加外源NO供体SNP、NO淬灭剂cPTIO对两菌株合成LiP的影响分析,揭示NO在白腐菌启动合成LiP中的作用和作用机理.[结果]两菌株均能在两种不同营养条件下产生NO,但NO的产生量与菌株及其营养状况有关,富营养使pc530产生NO量低且严重延后,而pcR5305产生NO并不需要营养饥饿激发且产生量显著高于pc530.除了LiP峰值出现时间迟于NO峰值时间外,NO含量与LiP合成呈正相关性;外施SNP对合成LiP有促进作用,但对pcR5305的促进作用没有pc530明显;15 mmol/L cPTIO使黄孢原毛平革菌合成LiP均大为降低,但并没有完全抑制产生LiP.[结论]黄孢原毛平革菌可能通过产生NO启动LiP的合成,但NO并不直接参与或影响合成LiP,NO更可能是作为一种上游的信号分子起作用.除了NO外,可能还有其它与NO有相互促进作用的信号分子也参与了LiP合成的调控.与pc530具有不同的产生NO的机制可能就是pcR5305抗营养阻遏合成木质素降解酶的机理.