黄孢原毛平革菌抗营养阻遏产漆酶诱变育种及其产酶特性

【目的】筛选能抗营养阻遏产漆酶的黄孢原毛平革菌,论证其产漆酶的确定性及抗营养阻遏产木质素酶的可行性,为白腐菌产酶代谢调控、木质素降解机理的研究奠定基础。【方法】利用重复紫外诱变法,以愈创木酚富氮鉴别培养基筛选目标菌株;比较不同营养条件下菌体生长与产酶动力学差异研究产酶营养调控机理;通过热处理、排除锰离子和加入过氧化氢酶等不同措施论证黄孢原平毛平革菌能否产生漆酶。【结果】3种不同方法均证实选育到的pcR5305和pcR5324菌株在限氮与富氮条件下均能产生漆酶,pcR5305和pcR5324在限氮条件下产漆酶分别达到203.5、187.6 U/L;在富氮条件下为220.6、183.9 U/L,而原菌株pc530在两种条件下都基本不产生漆酶。二菌株产漆酶调控方式不同,pcR5305漆酶产生与菌体生长同步,而pcR5324漆酶产生却受营养氮阻遏。二菌株同时具有抗营养阻遏高产木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)(分别为LiP 1343.2、MnP 252.2 U/L;LiP 1169.5、MnP 172.4 U/L)的能力。【结论】筛选到的黄孢原毛平革菌变异菌株能产漆酶,同时表现了抗营养阻遏产漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的能力,具有重要的生产应用与理论研究价值,为白腐菌产酶代谢调控机理研究提供了原始菌株并奠定了良好的基础。     

黄孢原毛平革菌抗营养阻遏产漆酶同工酶动态分析

以选育的抗营养阻遏产木质素降解酶黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）pcR5305、pcR5324为实验对象,研究了其在富氮条件下动态产漆酶同工酶的规律及其可能的营养调控机制。两菌株可在初始氨氮质量浓度达2.2 g/L的富氮环境下产漆酶,启动漆酶合成及达到产酶峰值对应的葡萄糖、氨氮浓度阀值远高于野生型,基质C/N的降低是漆酶合成启动及达到高峰的前提,其中碳浓度的降低更为重要。两菌株在不同时间可产生1～3种漆酶同工酶（分别为Lac1、Lac2和Lac3）,其中Lac3产酶伴随菌体整个生长过程,其合成启动与积累无需受基质碳氮饥饿及C/N的限制;Lac2在pcR5305初生代谢阶段产生,但只能在pcR5324次生代谢阶段产生;Lac1仅在pcR5305的初生代谢或次生代谢阶段产生,基质C/N降至5.0～7.0时诱导产生 Lac1的合成,并随培养时间的增加产酶量逐渐提高。显然3种同工酶的合成具有不同的调控机制。     

黄孢原毛平革菌基因启动子的分离与鉴定

利用启动子探针型载体pSUPV8直接在大肠杆菌(Escherichia coli)中分离黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)基因启动子片段,获得6个潮霉素抗性(Hyg-r)重组子。对重组子CH2、CH6进行序列分析,结果发现它们都存在真核生物基因启动子的保守序列;用原生质体转化法将其转化黄孢原毛平革菌,仅pCH6获得了潮霉素抗性转化子;PCR和斑点杂交分析表明,pCH6已成功导入黄孢原毛平革菌,并启动潮霉素抗性基因的表达。     

根癌农杆菌介导的白腐丝状真菌——黄孢原毛平革菌的转化

利用农杆菌介导的方法成功地对黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）进行了遗传转化。将含有潮霉素磷酸转移酶融合基因的双元质粒pCH61300转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）208中,然后用该转化菌分别感染黄孢原毛平革菌的分生孢子和原生质体,获得16株可能的转化子,经复筛,共获得6株潮霉素抗性水平为100μg/mL的稳定转化子,分生孢子和原生质体的转化频率没有明显差别。PCR检测结果显示,抗性基因已导入黄孢原毛平革菌细胞中;Southern杂交表明,TDNA以单拷贝形式整合到黄孢原毛平革菌基因组中。其中的一个转化子菌落形态与原野生型菌株相比有所不同,菌丝稀薄,分生孢子较少。利用分生孢子转化更为简便易行,无需特殊的设备和制备原生质体,此方法为深入开展该菌的遗传转化研究奠定了基础。     

黄孢原毛平革菌突变株抗碳氮营养阻遏产漆酶碳氮生理调控机理

【目的】通过比较不同碳氮营养及其消耗对产漆酶的影响,了解白腐菌模式种黄孢原毛平革菌解除营养阻遏产漆酶代谢的生理生态特性,揭示白腐菌合成漆酶的碳氮生理调控机理。【方法】分别利用限碳限氮(CL-NL)、限碳富氮(CL-NS)、富碳限氮(CS-NL)与富碳富氮(CS-NS)4种条件培养黄孢原毛平革菌野生型(WT)与突变株,比较两者产漆酶动力学、菌体生长、葡萄糖与氨氮消耗差异及其相关性来揭示解除营养阻遏产漆酶调控生理特性,明确C、N营养对产漆酶的生理调控途径。【结果】突变菌株除消耗速率比野生型略慢外,两者氨消耗趋势一致,但对葡萄糖的消耗比野生型快且氨氮浓度对葡萄糖的消耗影响不大。在CL-NL、CL-NS、CS-NL、CS-NS 4种培养条件下,野生型分别在培养后期的第11、14、19和19天的次生代谢时期产生0.107、0.029、12.84和18.05U/L漆酶,启动漆酶合成及酶峰值出现的时间与基质中葡萄糖耗尽或接近耗尽的时刻,或同氨氮消耗至最低值的时刻相对应;与WT产漆酶特性不同,突变株产漆酶伴随整个培养过程且均有两个产酶高峰,分别在培养的第8、7、12天和12天出现298.83、343.14、271.22、251.49U/L漆酶第一个产酶高峰,在培养的第12、13、19和19天产生257.69、298.78、213.81、216.93U/L漆酶的第二个产酶高峰。碳氮营养对产酶的影响显示:两菌株只要初始碳源浓度相同(限碳或富碳),各自产酶动力学趋势基本一致;相反,即使初始氮源浓度相同但其产酶动力学趋势却不同,说明碳源对黄孢原毛平革菌产漆酶的影响比氮源更为重要。【结论】野生型黄孢原毛平革菌产漆酶受碳或氮饥饿调控,碳、氮各自独立发挥作用且在不同的营养条件下由不同营养素所调控,如在限碳条件下产漆酶主要由葡萄糖饥饿启动,而在富碳条件下则由氨氮饥饿所激发,以碳或氮菌体负荷表示是否达到启动酶合成的调控阀值比单纯碳或氮浓度更为合理。突变菌株漆酶合成的启动不受碳、氮营养所阻遏,可能涉及一个全局调控的改变,解除了漆酶合成的营养阻碍。     

NaCl对黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的损伤效应

染料中含有大最NaCl是影响黄孢原毛平革菌脱色效率的重要因素。为研究NaCl对黄孢原毛平革菌处理功能的影响,分别采用孢子和菌丝球与不同浓度的NaCl混合培养10d,以观察孢子生长和菌丝球的损伤效应,并利用透射电子显微镜和AFLP法对其进行细胞结构分析与DNA扩增,通过分析不同浓度NaCl对其生长及微观结构的影响、NaCl浓度与DNA相似性关系以及构建UPGMA相似性树状图等方法,评价NaCl对P.chrysosporium结构与功能的损伤效应。结果显示,3％NaCl对黄孢原毛平革菌影响较小,细胞结构保持完整,异常细胞量为14．2％,DNA变异率小,与空白的相似度达90％以上,表明黄孢原毛平革菌在3％的浓度范围内结构功能基本不受影响;5％NaCl使DNA相似度下降为71．4％,下降幅度最为显著,并且细胞内含物松散和出现胞浆空泡化趋势,异常细胞占有量为71．1％,说明3％～5％的浓度范围最易对P．chrysosporium的结构与功能产生不良影响;NaCl浓度≥8％可对黄孢原毛平革菌产生严重损伤,细胞变形严重,空泡化,DNA相似度降至67％以下,异常细胞量约90％,表明此浓度范围可使黄孢原毛平革菌基本丧失了原有的结构与功能。     

黄孢原毛平革菌对黄瓜连作土壤酚酸物质的降解

研究了黄孢原毛平革菌对黄瓜连作土壤中对羟基苯甲酸、香草酸及阿魏酸的降解及连作障碍修复作用.结果表明,在摇瓶条件下,黄孢原毛平革菌在8 d内,对3种酚酸的降解率都达99％以上. 在连续种植7年黄瓜的大棚土壤中,施入黄孢原毛平革菌菌剂后,土壤中3种酚酸的含量都有所降低,降解率为54.46%. 与对照相比,修复土壤真菌数量变化无明显规律. 修复处理后黄瓜株高、茎粗、鲜质量及干质量无明显变化,黄瓜根部病害明显减轻,枯萎病及根结线虫病相对病情指数分别降低10.2%和14.6%.表明施入黄孢原毛平革菌剂对黄瓜连作障碍的解除具有一定的效果.     

黄孢原毛平革茵对黄瓜连作土壤酚酸物质的降解

研究了黄孢原毛平革菌对黄瓜连作土壤中对羟基苯甲酸、香草酸及阿魏酸的降解及连作障碍修复作用.结果表明,在摇瓶条件下,黄孢原毛平革菌在8 d内.对3种酚酸的降解率都达99%以上.在连续种植7年黄瓜的大棚土壤中,施入黄孢原毛平革菌菌剂后,土壤中3种酚酸的含量都有所降低,降解率为54.46%.与对照相比,修复土壤真菌数量变化无明显规律.修复处理后黄瓜株高、茎粗、鲜质量及干质量无明显变化,黄瓜根部病害明显减轻,枯萎病及根结线虫病相对病情指数分别降低10.2%和14.6%.表明施入黄孢原毛平革茵剂对黄瓜连作障碍的解除具有一定的效果.     

黄孢原毛平革菌降解土霉素的影响因素及酶活分析

目的:黄孢原毛平革菌降解土霉素的影响因素及酶活分析。方法:文章使用的方法有制备实验菌种和孢子悬浮液、测定校准曲线及样品与测定酶活性等。结果:培养基中的营养物质真菌降解抗生素和吸附重金属特性减少然后,产生了酶的次生阶段,不利于营养的获得,分泌了锰过氧化物酶,酶活不断增加,达到了最大值。活跃期过后,酶活逐渐降低,在培养后期,产生的代谢物越来越多,堆集了大量的有毒代谢物,降低了锰过氧化物酶活性。讨论:当土壤浓度维持在200mg/L时,采用固化或者是非固化的方式后,黄孢原毛平革菌对土壤的降解度分别为92.44%与67.63%。在实验过程中,使用了两种方式处理,但菌产锰过氧化物酶酶培养96h之后,土霉素达到了最大浓度,为70 mg/L,相应为527.40 U/L与73.90 U/L;使用两种处理方式,菌产木质素过氧化物酶都要先培养96h之后,土霉素浓度变成了70 mg/L,这个时候是最大值,相应为0.384 U/L与O.204 U/L,因此,黄孢原毛平革菌降解土霉素时,起到关键作用的是锰过氧化物酶。文章可行性研究了黄孢原毛平革菌降解土霉素。实验相应地考察了p H值、土霉素初始浓度是如何影响影响黄孢原毛平革菌降解土霉素。实验结果显示,相应地增加土霉素的浓度,能提升酶活,当超过一定限度时,酶的活性会随着增加而降低。     

黄孢原毛平革菌对松木、稻草和芦苇去木质化作用的研究

为确定黄孢原毛平革菌对不同植物材料的去木质化作用,以pH、干物质重、半纤维素、纤维素和木质素为主要技术指标,比较黄孢原毛平革菌对松木、稻草和芦苇降解能力的差异。松木、芦苇在发酵过程中pH呈下降趋势,稻草呈上升趋势。在干物质重、半纤维素、纤维素降解率三个指标上皆为松木〈芦苇〈稻草,在木质素降解率上则为松木〈稻草〈芦苇,且差异显著。表明黄孢原毛平革菌对不同植物材料去木质化能力有较大差异,其中芦苇的木质素降解率为13％,是三种材料中最易于被去木质化的。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.