中国东北地区人乳头瘤病毒16型全基因组克隆及HPV16.HaCaT重组细胞模型的构建及初步鉴定

为构建含东北地区人乳头瘤病毒16型(HPV16)全基因组的HPV16.HaCaT细胞模型,收集中国东北地区HPV16单一感染患者宫颈脱落细胞,提取DNA,将HPV16全基因组分成4个区段,通过4对特异性引物对HPV16全基因组进行分段扩增,测序后进行序列拼接及核酸序列分析,克隆HPV16全基因组序列;通过细胞转染,构建含HPV16全基因组的HPV16.HaCaT重组细胞模型;利用聚合酶链式反应(PCR)和细胞免疫荧光法检测重组细胞内HPV16早期基因的表达.成功克隆出中国东北地区HPV16全基因组序列(GenBank登录号:MW320358);构建了东北地区HPV16全基因组的重组质粒及HPV16.HaCaT重组细胞模型;证明了 HPV16早期基因E1-E4、E5、E6和E7在重组细胞模型内均有表达,从而获得中国东北地区HPV16全基因组序列及含有HPV16全基因组的HPV16.HaCaT重组细胞模型.     

家蚕snoRNA Bm-15的细胞定位及与类Notch受体基因的互作关系

【目的】前期研究中发现的一个家蚕Bombyx mori C/D box snoRNA Bm-15能够与类Notch受体基因(Notch-like receptor gene,NLR)发生体外互作。本研究旨在了解家蚕中snoRNA Bm-15与NLR的互作机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测snoRNA Bm-15和NLR在家蚕幼虫、蛹及成虫不同发育阶段的表达谱;利用原位杂交鉴定snoRNA Bm-15与NLR在BmN4细胞中的定位,以探索两者之间的互作机制。【结果】表达谱分析发现,snoRNA Bm-15及NLR在家蚕幼虫期的表达趋势基本一致,均呈现先下降后上升的趋势,2龄幼虫中表达量最低。在家蚕化蛹过程中,snoRNA Bm-15表达量呈现逐渐下降的趋势,到处女蛾时表达量最低。而NLR在雌虫化蛹后第1天表达量最低,处女蛾中表达量最高。利用原位杂交进行细胞定位发现,snoRNA Bm-15不仅存在于BmN4细胞核中,在细胞质中也有分布;而NLR则大部分分布于细胞核中,与Bm-15在核内有位置重叠。【结论】首次在鳞翅目昆虫中发现一个snoRNA Bm-15同时存在于细胞核和细胞质中,与其互作的基因NLR则主要存在于细胞核中,与Bm-15有位置重叠。二者在家蚕幼虫阶段存在一致的表达模式,在化蛹及化蛾过程中存在相反的表达模式,提示snoRNA Bm-15与NLR在家蚕不同发育阶段可能存在不同的互作模式。     

实验性糖尿病动脉粥样硬化大鼠模型的建立

目的建立糖尿病动脉粥样硬化的Wistar大鼠模型。方法10周龄雄性Wislar大鼠,以保护性剂量260mg／kg腹腔注射烟酰胺（Nicotinamide,NA）溶液,15分钟后尾静脉注射链尿佐菌素（streptozotocin,STZ）60mg／kg,同时给予维生素D3（VD3）注射液按总剂量60万IU／kg分三天灌胃,在上述基础上饲喂高脂高胆固醇饲料。测定大鼠血脂、血糖、胰岛素含量,制作胰腺、主动脉石蜡切片,观察其形态学变化。结果8周后大鼠空腹血糖≥7．8mmol,且HE染色可见胰岛增生、散在分布、形状不规则,主动脉内膜下有大量泡沫细胞聚集,中膜增生,结构紊乱。对照组未出现类似变化。结论该方法可用于糖尿病动脉粥样硬化Wistar大鼠模型的制作。     

辽宁省地区人乳头瘤病毒33型基因多态性分析

研究人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）33型E6和E7基因在辽宁省地区的基因多态性分布情况,增加对HPV33基因多态性地理分布情况的了解,为HPV33的诊断,靶向药和疫苗的研发提供理论依据。使用巢式PCR扩增方法对从已确诊HPV33阳性患者宫颈细胞提取的DNA样本进行E6和E7基因的扩增并测序,随后应用MegaX软件将所得测序结果与参考序列比对确定突变位点并进行系统发育树的构建。应用PAML4.9软件中的Codeml程序找出突变中的正向选择位点。分别应用ABC Pred server,ProPred-I server和ProPred server寻找理想的B细胞免疫表位,人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）I类结合表位和人类白细胞抗原（HLA）II类结合表位。共得到HPV33E6和E7序列各136个。与HPV33参考序列（M12732.1）进行比对后,E6基因中观测到17个单核苷酸突变,同义突变7个,非同义突变10个。E7基因中观测到9个单核苷酸突变,其中同义突变3个,非同义突变6个。系统发育分析显示HPV33E6和E7...     

草地贪夜蛾Sf9细胞中snoRNA Bm-15反义寡核苷酸的定位及其对Bm-15的干涉效率

【目的】利用反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)干涉昆虫核仁小RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)Bm-15的表达,并探索ASO进入细胞后的代谢途径。【方法】利用脂质体携带Cy5标记的、2'-O核糖甲基化修饰和硫代磷酸骨架修饰的Bm-15 ASO转染草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9细胞,然后通过Cy5标记与溶酶体及线粒体免疫荧光探针共定位研究Bm-15 ASO在细胞内的转运机制。利用实时荧光定量PCR检测转染Bm-15 ASO的Sf9细胞中Bm-15的表达量,分析ASO对snoRNA Bm-15的干涉效果。【结果】Bm-15 ASO转染草地贪夜蛾Sf9细胞48 h后,ASO荧光信号充斥整个细胞和位于细胞边缘的比例分别为34%和66%,说明ASO进入细胞后可能分布在不同的亚细胞器中;进一步对Bm-15 ASO和溶酶体及线粒体进行共定位发现,位于细胞边缘的ASO大多被运输至溶酶体而不会存在于线粒体等细胞器中。实时荧光定量PCR检测结果表明,转染Bm-15 ASO的Sf9细胞中Bm-15表达量下降了47%。【结论】即使经过多种化学修饰,ASO仍然逃避不了细胞内源降解机器的识别,这有效解释了某些情况下利用ASO干涉基因表达时靶标基因干涉效率较低的现象。     

利用体腔显微注射法实现非编码RNA在家蚕头部稳定过表达

【目的】通过体腔显微注射非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)过表达载体,研究注射后ncRNA在家蚕Bombyx mori幼虫不同组织中的表达情况,探索研究家蚕ncRNA功能的便捷方法。【方法】利用显微注射仪(玻璃显微注射针)在家蚕5龄第3天幼虫第7-8腹节褶皱处分别注射家蚕ncRNA Bm-15和Bm-152过表达载体piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-15]和piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152],注射48 h后提取家蚕幼虫头、胸、尾部、腹部背板、腹部腹板和丝腺总RNA,荧光定量PCR检测Bm-15和Bm-152在家蚕幼虫不同组织中的表达情况。【结果】采用玻璃显微注射针造成的创伤面小,注射后家蚕出现感染和死亡的比例低于10%。注射ncRNA Bm-15过表达载体后,在家蚕幼虫头部和尾部都检测到Bm-15的显著性过表达,头部中Bm-15表达量较注射piggyBac[A3-EGFP]空载体时上升了17倍,在其他4个组织中Bm-15表达量与正常饲养组家蚕对照相比变化不显著。注射Bm-152过表达载体后,同样在家蚕幼虫头部和尾部都检测到Bm-152的显著过表达,其中头部中的表达量较注射piggyBac[A3-EGFP]空载体时上升了6. 6倍。腹部背板和丝腺中Bm-152过表达效果也较明显,分别是注射piggyBac[A3-EGFP]空载体时表达量的3. 4和4. 5倍。【结论】体腔显微注射ncRNA过表达载体可以实现ncRNA在家蚕头部中稳定过表达。本研究为后续研究神经相关ncRNA的功能提供了较好的思路和方法。     

人乳头瘤病毒重组细胞模型应用的研究进展

人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）为双链环状小DNA病毒，它不仅能引起黏膜上皮的良性增生，也可以导致癌症如宫颈癌、阴茎癌、口咽癌的发生。HPV重组细胞模型的建立及其分化培养，可以应用于HPV早期感染、HPV感染对宿主细胞生命周期影响的研究，也可进一步诱导，用于深入研究DNA损伤修复途径对病毒复制的影响、以及HPV整合机制。本文将主要围绕HPV重组细胞模型的建立、分化培养的方法以及重组细胞模型的应用进行综述。