温度诱导Targetron系统用于大肠杆菌高效基因失活

构建基于TeI3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统 (Thermotargetron),并应用于中温微生物基因编辑。在大肠杆菌HMS174 (DE3) 基因组中,选择Subunit of flagellum基因 (fliC) 和C4 dicarboxylate orotate:H+ symporter基因 (dctA) 为靶基因。根据TeI3c/4c DNA识别规则,在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点。使用重叠延伸PCR方法,基于pHK-TT1A质粒构建打靶载体。打靶载体转化HMS174菌株,对数期转化子培养液48 ℃热激1 h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率。获得突变株后,通过琼脂穿刺和碳源代谢实验,鉴定ΔfliC、ΔdctA突变株表型变化。菌落PCR测序结果表明,TeI3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点,且打靶效率高达100%。突变株表型验证实验表明,ΔfliC突变株运动能力显著下降,ΔdctA突变株苹果酸代谢能力缺失。综上所述,文中建立了一套适用于嗜中温微生物的温度诱导型、高效基因失活系统,该系统可通过控制宿主菌在48 ℃保温时间实现高效、靶向、精准基因失活。     

抗菌肽Cec4的结构改造及抗菌活性研究

[目的]对抗菌肽Cec4进行结构改造,并评估优化小肽的稳定性及溶血性。[方法]采用序列截短、氨基酸替换的方式来改造Cec4。采用微量稀释法,检测改造后的Cec4对各类鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC)。绘制时间-杀菌曲线,并评估不同因素对抗菌肽抑菌活性的影响,最后通过溶血实验检测其安全性。[结果]①截短后的Cec4失去抑菌效果。②Cec4氨基酸替换后的Cec4-1、Cec4-2未能提升抑菌能力。Cec4-4的MIC值为Cec4的50%。③在24h,时间-杀菌曲线显示,Cec4-4的抑菌活性较Cec4高30%。④血清会影响抗菌肽活性,并且高浓度胰蛋白酶(1. 0 mg/m L)会抑制Cec4-4抗菌活性。⑤溶血实验表明Cec4-4在1 mg/m L浓度下无溶血反应。[结论]截短使Cec4失去抑菌活性,氨基酸替换后的Cec4-4对各测试菌的抑菌活性较母肽提升了1倍,且抗菌肽在1mg/m L浓度下对人体无溶血反应。