温度诱导Targetron系统用于大肠杆菌高效基因失活

构建基于TeI3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统 (Thermotargetron),并应用于中温微生物基因编辑。在大肠杆菌HMS174 (DE3) 基因组中,选择Subunit of flagellum基因 (fliC) 和C4 dicarboxylate orotate:H+ symporter基因 (dctA) 为靶基因。根据TeI3c/4c DNA识别规则,在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点。使用重叠延伸PCR方法,基于pHK-TT1A质粒构建打靶载体。打靶载体转化HMS174菌株,对数期转化子培养液48 ℃热激1 h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率。获得突变株后,通过琼脂穿刺和碳源代谢实验,鉴定ΔfliC、ΔdctA突变株表型变化。菌落PCR测序结果表明,TeI3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点,且打靶效率高达100%。突变株表型验证实验表明,ΔfliC突变株运动能力显著下降,ΔdctA突变株苹果酸代谢能力缺失。综上所述,文中建立了一套适用于嗜中温微生物的温度诱导型、高效基因失活系统,该系统可通过控制宿主菌在48 ℃保温时间实现高效、靶向、精准基因失活。     

fliL基因显著影响艰难拟梭菌运动功能及产孢能力

鞭毛基底体相关FliL家族蛋白(flagellar basal body-associated FliL family protein,fliL)基因编码FliL蛋白,FliL是一种与鞭毛基体相结合的单跨膜蛋白。为研究艰难拟梭菌fliL基因功能,使用非等长同源臂偶联等位交换(allele-coupled exchange,ACE)方法成功构建了fliL基因缺失(ΔfliL)和回补(::fliL)突变株,研究突变菌株与野生型菌株(CD630)生长曲线、抗生素敏感性、pH耐受性、运动能力及产孢能力等表型的差异。结果显示,菌株ΔfliL生长速率及最大生物量均小于菌株CD630,::fliL回补菌株生长情况回复至野生型。与CD630菌株相比,ΔfliL对阿莫西林、氨苄青霉素、诺氟沙星的敏感性提高,对卡那霉素、四环素敏感性降低,::fliL抗生素敏感性部分回复至野生型水平。与CD630菌株相比,ΔfliL游泳运动能力显著降低,::fliL运动能力超越野生型菌株CD630。相比菌株CD630,菌株ΔfliL在pH值为5时耐受能力显著提高,在pH值为9时,耐受能力显著降低。除此之外,ΔfliL产孢能力较CD630显著降低,::fliL产孢能力部分恢复。以上结果表明,艰难拟梭菌fliL基因与其运动能力、抗生素敏感性、环境耐受能力和产孢能力密切相关,可能进一步影响艰难拟梭菌菌株的致病力。     

平衡超滤技术对小儿先心病术后炎症因子、凝血功能及肺功能的影响

目的:探讨平衡超滤技术对小儿先心病术后炎症因子、凝血功能及肺功能的影响。方法:选择2014年9月至2017年9月我院接诊的100例先天性心脏病患儿进行研究,通过随机数表法分为观察组55例和对照组45例,两组均于体外循环下实施心内直视手术,观察组在体外循环启动后患儿复温时开始平衡超滤,并于体外循环结束后即刻进行改良超滤,对照组仅在体外循环结束后即刻进行改良超滤。比较两组不同时间点炎症因子、凝血功能及肺功能的变化、术后恢复情况及并发症。结果:于体外循环结束后(术后)20 min(T1)、术后2 h(T2)、术后6 h(T3)各时点,观察组血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-10均明显比对照组低(P<0.05);观察组各时点活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)均明显低于对照组(P<0.05);观察组各时点肺静脉顺应性(Cstat)、氧合指数(OI)在各时点均明显高于对照组,肺泡-动脉氧分压梯度(AaDO2)明显低于对照组(P<0.05);观察组血管活性药使用时间、呼吸机使用时间和ICU住院时间均明显比对照组短(P<0.05),观察组感染、弥散性血管性凝血、肺功能损伤等发生率明显低于对照组(P<0.05)。结论:在改良超滤技术上,联合平衡超滤更有助于减轻小儿先心病术后炎症因子的释放,具有较好的凝血功能、肺功能保护作用,可有效促进术后恢复,减少围术期并发症。     

CD630＿27900基因缺失显著降低艰难拟梭菌自溶速率、毒力及对酸和抗生素的耐受性

艰难拟梭菌(Clostridioidesdifficile)CD630＿27900基因位于slpA-cwp66基因座上,CD630＿27900基因属于假定的Lmbe家族的酶,但基因功能尚未明确。【目的】本研究通过构建艰难拟梭菌CD630＿27900基因敲除菌株,比较野生型菌株(CD630)与突变株表型差异,探讨CD630＿27900基因对艰难拟梭菌感染的影响。【方法】用非等长同源臂偶联等位交换(allele-coupled exchange, ACE)构建CD630＿27900基因缺失菌株与回补菌株。比较它们在生长曲线、自溶素(cwp19,Acd)基因表达、细胞毒力、主要毒素基因表达、抗生素及pH敏感性差异,以研究CD630＿27900基因的功能。【结果】成功构建△CD630＿27900突变菌株和::CD630＿27900回补菌株。菌株△CD630＿27900在衰亡期自溶速率显著低于菌株CD630,::CD630＿27900自溶速率恢复。实时荧光定量聚合酶链反应(real-timefluorescencequantitative polymerasechainreaction,RT-q...