大连渤海老虎滩海域沉积物可培养放线菌的多样性

【目的】研究大连渤海老虎滩海域可培养放线菌的多样性。【方法】利用5种不同的培养基分离、培养海洋沉积物中的放线菌,并用16S rRNA基因序列对部分放线菌株进行系统发育分析。【结果】根据菌落表型共分离到1215株放线菌。选择271株具有代表性的菌株进行16S rRNA分析,结果表明,251株(92.26%)属于放线菌门,覆盖11个科,15个属;其余20株属于厚壁门和变形菌门;有7株为潜在的新种。【结论】大连渤海老虎滩海域的沉积物中存在较为丰富的放线菌和新种资源,这些菌株为将来开发新的微生物代谢产物奠定了基础。     

耐热链霉菌4″-O-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达

拟研究异源调控系统提高耐热链霉菌Streptomyces thermotolerans 4″-O-异戊酰基转移酶基因(ist)表达的可能性。在麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarofaciens 1748中曾克隆到BamHⅠ~8.0 kb片段,含此基因片段的变铅青链霉菌TK24 Streptomyces lividans TK24转化子可将螺旋霉素高效转化为丙酰螺旋霉素。序列分析表明此片段除包含麦迪霉素4″-O-丙酰基转移酶基因(mpt)外还存在与其连锁的两个正调控基因orf27和orf28。将这个基因簇中mpt基因的orf替换为ist基因的orf,然后与两个正调控基因或者单独一个orf27连接,将这些构建好的片段分别克隆到中等拷贝数及高拷贝数载体pKC1139和pWHM3上,再转化到S.lividans TK24中。通过测定S.lividans TK24转化子中螺旋霉素生物转化为4″-O-酰化螺旋霉素的产率来评价mpt和ist基因的表达水平。结果表明只有高拷贝载体pWHM3构建的重组质粒S.lividans TK24转化子中才能明显检测到4″-O-异戊酰螺旋霉素的产生。mpt基因的正调节系统可以提高ist基因的表达水平,含两个调节基因的转化子转化效率高于含单一调节基因的转化子。     

淀粉酶抑制剂与抗虫的研究进展

本文综述了α淀粉酶抑制剂对α淀粉酶特异性抑制的分子机制,以及α淀粉酶抑制剂在转基因抗虫方面的研究现状和应用前景。     

格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始单位的合成, 而萘醌类的AHBA基因簇可能参与未知安莎化合物的生物合成。为提高吸水链霉菌17997菌种的Gdm发酵产量, 并研究高产菌种在固体培养基上孢子的生长周期。采用基因阻断技术, 将吸水链霉菌17997中的萘醌类AHBA生物合成基因簇(shnSOP)进行破坏, 以获得DSOP菌株, 从而减少对合成所需共同底物AHBA的争夺。HPLC分析结果表明DSOP菌株Gdm的发酵产量比原株提高185%。同时, 通过孢子计数发现该菌株在固体培养基上的孢子生长经历2个周期, 第2代孢子菌种的Gdm产量较高。     

高效液相色谱-串联质谱分析微量格尔德霉素类似物

安莎类抗生素例如利福霉素和安丝菌素,通常由一组化学结构相似的组分组成。格尔德霉素为苯安莎类抗生素,已经发现4个组分。本研究采用高效液相色谱-串联质谱方法对格尔德霉素(GDM)制品中的微量组分进行了分析,发现5个新的和1个已知的GDM类似物。依据质谱数据、结合GDM生物合成机制,对6个GDM类似物的化学结构进行了推测:分子式为C29H42N2O10的新化合物3个,分别为GDM安莎链上C2-C3、C4-C5和C8-C9之间的C-C双键变为单键并同时单羟基化的GDM衍生物;分子式为C28H38N2O8的新化合物2个,其中1个为17(或12,或4)-去甲氧基格尔德霉素,另1个为4,5-双氢-10,11-脱水-17-去甲基-17-羟基格尔德霉素;分子式为C29H42N2O9的已知化合物1个,为4,5-双氢格尔德霉素。这些GDM类似物的发现有助于加深对GDM生物合成的认识,并对通过基因阻断、组合生物合成技术获得GDM衍生物的研究有启示作用。     

格尔德霉素生物合成的调控基因

从吸水链霉菌17997中克隆了格尔德霉素(Geldanamycin, Gdm)生物合成酶基因簇, 通过生物信息学分析发现两个LAL(Large ATP-binding regulators of the LuxR family)家族的调控基因gdmRI和gdmRII, 基因阻断和基因回复实验证实这两个基因产物都正调控Gdm的生物合成。     

格尔德霉素生物合成的调控基因

从吸水链霉菌17997中克隆了格尔德霉素(Geldanamycin, Gdm)生物合成酶基因簇, 通过生物信息学分析发现两个LAL(Large ATP-binding regulators of the LuxR family)家族的调控基因gdmRI和gdmRII, 基因阻断和基因回复实验证实这两个基因产物都正调控Gdm的生物合成。     

利用CRISPR-Cas9系统构建新型异戊酰螺旋霉素Ⅰ产生菌

异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin,ISP)Ⅰ是必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)的一种主组分,其抗菌活性与BT相似,而且作为单一组分在质控和剂型上更具优势,目前正在进行临床前研究。原有的 ISPⅠ工程菌株经过3次基因改造,已经具有2种抗性基因,很难再进行遗传操作。前期研究利用经典同源重组的方法无法构建无抗性的ISPⅠ产生菌,文中利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在螺旋霉素(Spiramycin,SP)产生菌中成功将3位酰基化酶的基因bsm4替换为组成型强启动子ermEp~*控制下的异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltansferase gene,ist)。删除bsm4后突变株只能产生SPⅠ组分,外源基因ist的表达产物催化SPⅠ在其4″位进行异戊酰化修饰形成ISPⅠ。经过HPLC和质谱鉴定,阳性菌株ΔEI的发酵产物中只有ISPⅠ一种ISP组分,证实新的ISPⅠ工程菌株构建成功。ΔEI菌株不带有抗性基因,可重复利用CRISPR-Cas9系统进行基因操作来获得新的改良菌株。     

利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌

可利霉素 (Carrimycin,CAM) 是将异戊酰基转移酶基因 (Isovaleryltransferase gene,ist) 导入到螺旋链霉菌中产生的以异戊酰螺旋霉素 (Isovalerylspiramycin,ISP) 为主组分的抗生素。原工程菌中的ist基因与螺旋霉素 (Spiramycin,SP) 生物合成基因簇相距较远,且具有两种抗性基因,难以对其进行基因改造,因此需要构建新型CAM工程菌株。文中通过CRISPR-Cas9基因编辑系统靶向切割2个位点,将ist和其正调控基因acyB2通过同源重组插入到SP生物合成基因簇附近且不参与SP合成的orf54基因下游,获得2种无外源抗性基因插入的CAM产生菌54IA-1和54IA-2,经发酵产物检测发现54IA-2菌株中的ISP产量明显高于54IA-1菌株。通过实时定量PCR (Quantitative real-time PCR,qPCR) 检测证实54IA-2菌株中ist和acyB2基因以及部分SP生物合成基因的表达量均高于54IA-1菌株。为进一步获得高产菌株,以54IA-2为出发菌株,利用核糖体工程的方法筛选利福平 (Rifampicin,RFP) 抗性菌株,在RFP浓度为40 μg/mL的抗性菌株中,ISP的产量明显提高,最高可达842.9 μg/mL,比原始菌株提高约6倍。对其中7株菌的rpoB基因进行测序分析,每株菌的第576位丝氨酸都突变为丙氨酸,在其他错义突变中产量最高的菌株RFP40-6-8在第424位的谷氨酰胺突变为亮氨酸。综上所述,本研究应用CRISPR-Cas9系统成功构建了无任何抗性标记的新型CAM工程菌株54IA-1和54IA-2,并通过核糖体工程技术筛选获得了新型CAM高产菌株RFP40-6-8,为CAM工程菌株的进一步优化改造奠定了基础。