浙江清凉峰国家级自然保护区野猪空间分布及活动节律

为了解浙江清凉峰国家级自然保护区内野猪(Sus scrofa)的分布及活动节律,2018年3月至2019年2月,我们利用红外相机技术对其进行了网格化监测。在千顷塘和龙塘山区域总计布设109个红外相机监测点,共计调查39 240个相机日。结果表明,在千顷塘区域,野猪倾向于在落叶阔叶林(拍摄率5.33 ±5.64)和针阔混交林(3.75 ±3.46)活动,而在龙塘山区域,则倾向于针阔混交林(4.32 ±5.21);千顷塘与龙塘山区域野猪各月间的日活动差异指数α均存在极显著差异(P < 0.01),冬季的α值高于其他季节;昼行性指数β的平均值分别为0.870和0.768,显著高于理论值13/24(P < 0.01),表明清凉峰的野猪种群具有明显的昼行性特征,且在冬季的活动时间分配较之其他季节更不均匀。通过核密度估计法分析不同季节野猪的日活动节律发现,保护区内野猪春季有晨昏两个活动高峰(08:00-10:00、17:00-19:00),冬季活动高峰出现在午后(13:00-17:00),其他季节无明显活动高峰。本研究有助于加深对野猪华南亚种生态习性的认知,为保护区的野生动物管理工作提供科学依据。     

同域分布的黑麂和小麂的时空生态位分化

生态位分化是解释物种共存的重要理论。Schonenr认为空间维度对生态位差异形成的影响程度最高,营养维度次之,时间维度则最后被启动。为验证这一假说,我们于2018年12月至2019年11月,在浙江清凉峰国家级自然保护区龙塘山区域采用公里网格法布设52台红外相机,对同域分布且食性相似的黑麂和小麂种群进行监测,计算平均拍摄率,分析不同季节黑麂和小麂对不同植被类型、海拔、坡位、水源距离的选择差异,并运用核密度估计法分析二者日活动节律及重叠程度。结果显示,(1) 黑麂和小麂对空间生态位的选择出现分化：黑麂偏好针阔混交林,主要栖息于1 301 ~ 1 500 m的高海拔地区,回避下坡位和谷地,在距离水源较近的区域内活动频繁;小麂则偏好落叶阔叶林,主要栖息于901 ~ 1 100 m的中海拔地区,偏好中坡位,回避谷地,对水源距离没有明显的选择倾向。(2) 黑麂和小麂均为晨昏性活动的昼行性动物,二者全年日活动节律重叠程度较高 (Δ4 = 0.86),仅冬季较低 (Δ1 = 0.65)。上述结果支持Schonenr的假说：首先,空间维度对物种生态位分化的影响大于时间维度,龙塘山区域黑麂和小麂主要通过选择不同的栖息地来增加空间回避,降低二者的竞争;其次,这种模式存在季节差异,冬季由于可利用的资源减少,竞争加剧,二者通过调整日活动节律,增加时间生态位分化程度,从而实现同域共存。     

大鼠胃纵行和环行平滑肌对细胞外核苷引起的差异收缩反应

目的：观察几种细胞外核苷如ATP、urIP和四磷酸脲腺苷（Up4A）在胃纵行平滑肌（Ⅲ）和胃环行平滑肌（CM）中引起不同的反应,P2X和P2Y受体拮抗剂以及环氧合酶抑制剂五磷酸二肌苷（11＇5I）、苏拉明（suramin）和吲哚美辛对№A在删和CM中引起的收缩的影响。方法：取大鼠全胃,分离LM和CM,使用organbath系统测量平滑肌收缩。结果：Up4A可以在I_aM和CM中引起与ATP和U1P类似的收缩;IP5I对LM和CM中由Up4A引起的收缩并无影响;但suramin和吲哚美辛则能在CaM中显著抑制由Up4A引起的收缩,而LM中无此现象。结论：两种胃平滑肌对核苷类药物及其抑制剂的反应有差异。     

拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。     

(S)-酮基布洛芬拆分用脂肪酶基因的克隆及表达

本实验室筛选出一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。通过构建其基因文库,从中筛选得到阳性克隆重组子pUC-NK1。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为633bp的脂肪酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该脂肪酶基因属首次发现(GenBank Accession No.EU381317),将此基因克隆到原核表达载体pET21b(+)中构建重组表达质粒pET-NKest1,转化Escherichia coli BL21,经Isopropyl-β-D-Thiogalactoside(IPTG)诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该脂肪酶成熟蛋白分子量约为20kDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯得到(S)-酮基布洛芬过量(e.e.%),由野生菌NK13的5.84%提高到75.28%,提高约15倍,说明该脂肪酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。     

浙江清凉峰国家级自然保护区华南梅花鹿栖息地内人为干扰类型及时空分布格局

定量分析保护地内的人为干扰对珍稀濒危物种的保护非常重要。红外相机技术可为评估人为干扰提供重要数据。我们于2014年11月至2017年12月,利用红外相机对浙江清凉峰国家级自然保护区千倾塘区域的野生华南梅花鹿（Cervus nippon kopschi）栖息地存在的人为干扰进行了监测调查。共计布设57个监测位点,记录到人为干扰独立照片152张。识别到7个主要干扰类型,分别为行走干扰、盗采干扰、盗伐干扰、盗猎干扰、牛干扰、羊干扰、家犬干扰。研究结果表明,栖息地内的人为干扰与梅花鹿的活动节律和重要分布区域存在一定的重叠。人类干扰（包括行走、盗采、盗伐、盗猎）是主要干扰。干扰高发季节为春、秋季。行走干扰、采伐干扰、家犬干扰在上半年（1-6月）最高。牛干扰在4月和11月较高,羊干扰在4月和9月最高。保护区内干扰主要出现在07：00-18：00,干扰强度最高的时间段为08：00-10：00。从空间分布上,华南梅花鹿的主要分布小区（道场坪、癞痢尖、螺蛳尖）以及重要水源地（千倾塘）干扰强度较高。人类干扰和家犬干扰集中于千倾塘区域西部,放牧干扰集中于千倾塘区域东部。本次研究为利用红外相机进行保护区内人为干扰研究提供了案例,同时为管理部门制定和实施有效管理策略提供了科学依据。     

浙江清凉峰国家级自然保护区千顷塘区域鸟兽资源的红外相机调查

红外相机已经被广泛应用于野生动物多样性调查中,这为制定有效的保护管理策略提供直接的科学依据。2014年11月至2016年10月,共布设46~51个相机位点(网络),对浙江清凉峰国家级自然保护区千顷塘区域内的鸟兽资源进行连续监测。共获得鸟兽独立有效照片10149张,其中兽类占88%(8932张),鸟类占12%(1212张)。经鉴定,兽类14种,鸟类34种,其中包括2种国家I级重点保护野生动物(华南梅花鹿Cervus nippon kopschi和白颈长尾雉Syrmaticus ellioti)和5种国家II级重点保护野生动物(中华鬣羚Capricornis milneedwardsii、勺鸡Pucrasia macrolopha、白鹇Lophura nycthemera、凤头鹰Accipiter trivirgatus、领角鸮Otus lettia )。本次调查发现丘鹬（Scolopax rusticola）、橙头地鸫（Geokichla citrina）、虎斑地鸫（Zoothera aurea）、灰背鸫（Turdus hortulorum）、白腹鸫（Turdus pallidus）、红尾斑鸫（Turdus naumanni）及斑鸫（Turdus eunomus）为该区域新纪录鸟类。兽类中相对丰度指数最高的前3种动物分别是小麂（Muntiacus reevesi） (56.85)、华南梅花鹿(16.25)和野猪（Sus scrofa） (13.91),鸟类中相对丰度指数最高的3种动物是白鹇(6.49)、棕噪鹛Garrulax berthemyi (2.43)和勺鸡(1.54)。另外,鸟兽物种数在1051~1259m海拔段显著高于851~1050 m海拔段;阔叶林的物种数显著高于针叶林的物种数,然而阔叶林与针阔混交林的物种数无显著性差异。本研究结果表明,红外相机能够有效调查浙江清凉峰国家级自然保护区千顷塘区域的鸟兽多样性,该调查法对于监测大中型兽类和部分鸟类具有一定优越性,所采集数据对保护区实施针对性的保护措施具有重要指导意义。     

内耳免疫反应诱导Fas和FasL表达与凋亡的关系

目的研究内耳免疫反应过程中是否存在细胞凋亡,以及细胞凋亡是否与Fas和FasL信号转导有关.方法选用雌性白色豚鼠16只,随机分为实验组和对照组各8只,以钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)全身免疫后,实验组以相同抗原进行内耳免疫,对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS),在内耳免疫5d后处死动物,取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片.通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)检测内耳凋亡细胞,免疫组化检测内耳Fas和FasL的表达.结果实验组豚鼠内耳Corti器毛细胞,血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞存在TUNEL染色阳性细胞,而对照组动物切片仅在支持细胞、血管纹和螺旋神经节细胞中发现极少数TUNEL染色阳性细胞.免疫组化染色实验组Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带Fas和FasL蛋白表达阳性,而对照组只有螺旋神经节细胞和血管纹有较弱的Fas蛋白表达,FasL蛋白表达阴性.结论内耳免疫反应可诱导细胞凋亡的发生,Fas-FasL途径是参与此过程重要的信号转导途径之一.     

一种快速、经济提取外周凝血基因组DNA方法的建立

目的：建立一种经济、快速且高质量提取人体外周凝血DNA的方法。方法：摸索最佳的匀浆条件,对外周凝血块进行匀浆,采用Ⅺ法对匀浆液进行基因组DNA的提取,通过凝胶电泳、单重PCR和多重PCR检测凝血基因组DNA的提取产量和质量。并分别与常规的凝血基因组DNA提取方法,即蛋白酶K消化法,以及提取抗凝血基因组DNA的Ⅺ法进行比较分析。结果：最佳的匀浆条件为：39000map,15秒。在此条件下提取的基因组DNA完整性好,纯度和产量与蛋白酶K消化法提取凝血DNA和KI法提取抗凝血DNA的结果相比,没有统计学差异。单重PCR和多重PCR也获得了理想的扩增结果。结论：与常规的外周凝血提取方法相比（蛋白酶K消化法）,本方法节省了时间和成本,能快速、经济、有效地提取外周凝血基因组DNA,可用于后续的科研和临床诊断需要,解决了部分科研机构血液基因组DNA的样本来源问题。     

一种快速、经济提取外周凝血基因组DNA 方法的建立

目的:建立一种经济、快速且高质量提取人体外周凝血DNA的方法。方法:摸索最佳的匀浆条件,对外周凝血块进行匀浆,采用KI法对匀浆液进行基因组DNA的提取,通过凝胶电泳、单重PCR和多重PCR检测凝血基因组DNA的提取产量和质量,并分别与常规的凝血基因组DNA提取方法,即蛋白酶K消化法,以及提取抗凝血基因组DNA的KI法进行比较分析。结果:最佳的匀浆条件为:39000 rmp,15秒。在此条件下提取的基因组DNA完整性好,纯度和产量与蛋白酶K消化法提取凝血DNA和KI法提取抗凝血DNA的结果相比,没有统计学差异。单重PCR和多重PCR也获得了理想的扩增结果。结论:与常规的外周凝血提取方法相比(蛋白酶K消化法),本方法节省了时间和成本,能快速、经济、有效地提取外周凝血基因组DNA,可用于后续的科研和临床诊断需要,解决了部分科研机构血液基因组DNA的样本来源问题。