拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。     

多渠道建立生物化学综合实验,增强学生科研能力

生物化学实验教学体系中,"综合性实验"在训练学生实验设计思路、引导学生掌握生物化学基本实验技术的综合运用中,起着举足轻重的作用。为推进综合实验内容改革,充分发挥其功能,我们借助本科生百项工程、生物实验教学中心仪器平台、以及高层次科研项目等不同途径,建立了多层面的生物化学综合实验,并在教学实践中进行了有益的尝试。     

(S)-酮基布洛芬拆分用脂肪酶基因的克隆及表达

本实验室筛选出一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。通过构建其基因文库,从中筛选得到阳性克隆重组子pUC-NK1。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为633bp的脂肪酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该脂肪酶基因属首次发现(GenBank Accession No.EU381317),将此基因克隆到原核表达载体pET21b(+)中构建重组表达质粒pET-NKest1,转化Escherichia coli BL21,经Isopropyl-β-D-Thiogalactoside(IPTG)诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该脂肪酶成熟蛋白分子量约为20kDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯得到(S)-酮基布洛芬过量(e.e.%),由野生菌NK13的5.84%提高到75.28%,提高约15倍,说明该脂肪酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。     

藏中矿区珠芽蓼和尼泊尔酸模中重金属含量分析

西藏中部主要是指雅鲁藏布江河谷地带,包括拉萨、日喀则和泽当等地市,是西藏自治区的主要农区和工业矿区。西藏中部矿产资源丰富,其中cu的远景储量居全国第2位[1]。矿产的开发给当地居民带来巨大的经济效益,但同时也排放大量含有重金属的废渣、废水和废气,导致土壤重金属污染严重。土壤是中草药中重金属的主要来源之一,中草药中的重金属含量与地质背景有密切的关系,土壤中重金属元素的多寡在药用植物中都有所表现[2];土壤重金属污染对中草药品质有影响甚至危及人类健康[3]。近年来植物药在国际市场逐渐升温,传统医药在日益受到人们青睐的同时其质量与安全性也成为公众关注的焦点[4-6]。     

青海省高寒灌丛物种多样性、生物量及其关系

物种多样性对生态系统功能的作用是生物多样性研究的核心领域之一,生物量水平是生态系统功能的重要表现形式,而植物群落的生物量则是生态系统生物量的基础,因此研究植物群落物种多样性与生物量的关系,对于阐明植物多样性对生态系统功能的作用具有重要意义。通过对青海省高寒灌丛生物量、灌丛物种多样性特征以及与生物量的关系调查,得到以下结果:(1)被调查灌木植被群落的40个样地中共出现了207种植物(其中灌木植物18种,草本植物189种),隶属于130属,43科,灌木以蔷薇科、杜鹃花科为主,而草本以菊科、龙胆科、毛茛科和莎草科占优势。(2)群落多样性指数偏低,植物群落结构简单,物种组成稀少。小叶金露梅群落的多样性指数最大,金露梅群落、细枝绣线菊群落和鲜卑花群落次之,百里香杜鹃+头花杜鹃群落最低。(3)不同高寒灌丛类型生物量介于1893.03—7585.41 g/m~2之间,平均值为3775.9 g/m2,其中灌木生物量占灌丛总生物量的73.55%,草本为26.45%。(4)总生物量随草本物种多样性和群落物种多样性的增加而减小;草本生物量随其物种多样性的增加而减小,而灌木物种多样性与其生物量并无显著相关性。     

拆分获得(R)-酮基布洛芬酯酶基因的筛选、克隆与表达

以自筛选出的具有一定不对称拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的野生菌Bacillus megaterium NK13为材料,通过构建其基因文库,筛选得到一个阳性克隆重组子pUC18-NK-HYD3。分析测序结果发现外源片段中包含一段完整的741 bp的开放阅读框,其编码的蛋白中含有酯酶的GXSXG保守序列。经在NCBI的BLAST系统中比对,证明该酯酶基因属于首次发现(GenBank Accession Number: GU143552)。将酯酶基因克隆到载体pET21b(+)中,转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后在宿主菌得到表达。SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为28 kDa。TLC和HPLC检测结果显示,该酯酶优先水解(R)-型底物,在重组菌菌液体系,转化率为15%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)最高,达62.74％;改用重组菌湿菌体的PBS体系后,在转化率为10%~50%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)一直保持在73%~76%之间。