载基因壳聚糖纳米粒的制备及免疫增强作用的初步研究

摘 要 目的: 制备壳聚糖载基因纳米粒,并对其体外转染效率及其在小鼠体内的免疫增强效果进行初步研究。方法: 以本课题组构建的口蹄疫DNA疫苗为模型药物,采用复凝聚法制备纳米粒;用透射电镜观察形态;用纳米粒度分析仪测定粒径、多分散度和zeta电位;凝胶阻滞分析测定基因在纳米粒中的位置;用体外基因转染实验评价纳米粒的转染活性。用载基因壳聚糖纳米粒免疫雌性Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果: 所制备的载基因纳米粒形态规则、大多成球形,平均粒径约为150nm,多分散度＜0.26,zeta电位约为21mV;凝胶分析结果表明质粒DNA与壳聚糖分子间可以通过电性结合作用而完全结合,基因几乎全部被包裹在纳米粒内部;体外基因转染实验表明壳聚糖作为一种新型的非病毒基因递送载体能够高效传递DNA进入BHK-21细胞,基因能够在该细胞中高效表达;小鼠免疫实验表明纳米粒不仅能诱导机体产生较高的细胞免疫水平,而且体液免疫水平也显著提高。结论: 壳聚糖纳米粒能将基因递送到细胞内并且能够表达,小鼠免疫实验显示其具有良好的免疫增强效果。     

共表达O型口蹄疫病毒3C、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒免疫原性研究

目的 对本室已筛选到的一株共表达O型口蹄疫病毒3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18进行免疫原性研究。方法 分别用重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18、rFPV-P1-2A-3C和对照组282E4株FPV、PBS对小鼠进行免疫接种,并检测各免疫组的T 淋巴细胞亚类数量、CTL杀伤活性及抗体效价。结果 重组鸡痘病毒疫苗组免疫小鼠T 淋巴细胞亚类数量,CTL杀伤活性和抗体效价均显著高于对照组,且重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18的小鼠T 淋巴细胞亚类数量和CTL特异性杀伤活性与rFPV-P1-2A-3C相比,差异显著。结论 本实验为开发新型FMDV疫苗奠定了实验免疫基础。     

共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18的重组鸡痘病毒的构建

目的:为获得能有效预防O型口蹄疫病毒的重组鸡痘病毒活载体疫苗奠定基础。方法：在O型口蹄疫病毒P1-2A基因上游引入Kozak序列,下游通过Linker与细胞因子IL-18联结,获得P1-2A基因与猪IL-18基因融合表达基因盒P1-2A-IL-18,将该表达基因盒克隆至鸡痘病毒中间转移载体pUTAL-3C中,构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-3C- P1-2A-IL-18。通过脂质体转染法,将pUTAL-3C- P1-2A-IL-18与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,通过BrdU三次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株。结果：经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-IL-18基因盒。结论：成功获得了一株共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘毒疫苗候选株rFPV-3C-P1-2A-IL-18。