共表达O型口蹄疫病毒3C、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒免疫原性研究

目的 对本室已筛选到的一株共表达O型口蹄疫病毒3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18进行免疫原性研究。方法 分别用重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18、rFPV-P1-2A-3C和对照组282E4株FPV、PBS对小鼠进行免疫接种,并检测各免疫组的T 淋巴细胞亚类数量、CTL杀伤活性及抗体效价。结果 重组鸡痘病毒疫苗组免疫小鼠T 淋巴细胞亚类数量,CTL杀伤活性和抗体效价均显著高于对照组,且重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18的小鼠T 淋巴细胞亚类数量和CTL特异性杀伤活性与rFPV-P1-2A-3C相比,差异显著。结论 本实验为开发新型FMDV疫苗奠定了实验免疫基础。     

表达猪瘟病毒石门株E0基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验

应用PCR从质粒pMD18-T-E0中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上,进一步构建出重组鸡痘病毒转移载体FPV-pSY-E0.用脂质体将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)后,通过蓝斑纯化实验筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E0.PCR证实E0基因已整合至鸡痘病毒基因组中,Western blot检测到重组病毒感染CEF细胞中E0蛋白的表达.重组病毒3次腹腔接种小鼠,ELISA检测血清抗体滴度高达1∶4 096.重组病毒免疫猪3次之后,接种猪瘟病毒强毒进行攻毒试验,结果对免疫组产生75%的保护率,为研制猪瘟活载体疫苗奠定了基础.     

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。     

表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测

从ConA刺激的鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因编码区。将该编码区Cdna序列和调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子（PE/L）的基因片段定向克隆到鸡痘病毒转移载体p1175中,获得重组转移载体P1175il2,然后转染已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV）的鸡胚成纤维细胞（CEF）,质粒P1175il2与wt-FPV基因组DNA发生同源重组,产生了表达ChIL-2的重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得并纯化重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。应用XTT/PMS方法检测的Rfpv-IL2 （M.O.I 2.0）感染CEF 72小时后细胞上清中表达的重组ChIL-2生物活性,效价为3.6×105u/Ml,表明Rfpv-IL2能有效地表达ChIL-2。下一步将利用Rfpv-IL2在体内表达ChIL-2,研究ChIL-2的免疫增强作用及其作用机理。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-18基因重组禽痘病毒的构建

[目的]获得共表达H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组禽痘病毒.[方法]将含痘病毒启动子LP2EP2的HA基因和鸡IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSYHA/IL-18.用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA和IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-HA-IL-18).在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组禽痘病毒又进行了多次蚀斑克隆.[结果]以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因和鸡IL-18基因引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb带和1条0.6 kb左右的带.以间接免疫荧光试验、T细胞转化试验和SPF雏鸡免疫接种证实重组禽痘病毒能表达HA和鸡IL-18,并初步证明鸡IL-18增强HA免疫作用.[结论]重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA和鸡IL-18.     

共表达HIV-1中国流行株gp120与IL-18重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性观察

为筛选我国的HIV-1疫苗候选株,以鸡痘病毒282E4中国疫苗株为载体,构建了共表达中国流行株HIV-1外膜蛋白gp120和IL-18的重组鸡痘病毒,并将该重组鸡痘病毒免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平。结果显示,HIV_1外膜蛋白gp120和IL-18不但可在重组鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞中表达,而且可在重组鸡痘病毒感染的哺乳动物细胞中表达。重组病毒具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性抗体和脾特异性CTL反应,且IL_18发挥了免疫佐剂的作用。本研究结果为制备安全、有效的HIV-1基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

利用Cre-loxP自动敲除H5亚型禽流感病毒血凝素重组鸡痘病毒中的报告基因

研究去除重组鸡痘病毒中的报告基因,构建一株只含目的基因的重组毒。将H5亚型AIV的HA基因作为靶基因,两侧含loxP序列的GFP表达盒插入鸡痘病毒重组臂基因构建了转移质粒载体,将其与脂质体混合转染CEF细胞,获得了表达H5和GFP的鸡痘病毒重组体。通过二次转染,利用Cre酶自动敲除重组病毒中的GFP基因,最终获得了只含H5血凝素基因表达盒的重组鸡痘病毒。免疫荧光和病毒滴度测定结果表明,经过连续传代后重组病毒仍然稳定复制并表达H5血凝素。用10⁵PFU和2×10⁵PFU rFPV H5免疫SPF鸡,28d后,免疫组鸡抗体平均滴度(HI)分别达到4log 2和4.5log 2,结果表明,H5HA基因重组病毒能刺激鸡群产生较高特异抗体。     

传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因在重组禽痘病毒中共表达

在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提 ,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒 (ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上 ,构建了含有ILTVgB基因和新城疫病毒 (NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F ,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维 (CEF)细胞后 ,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒 (rFPV-gB-F) ,并进行了 6轮蚀斑纯化。Western blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTVgB基因和NDVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。     

传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因在重组禽痘病毒中共表达

在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上,构建了含有ILTV gB基因和新城疫病毒(NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维(CEF)细胞后,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒(rFPv-gB-F),并进行了6轮蚀斑纯化。Western-blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTV gB基因和NBVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。     

表达鸡新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒的构建及其特性研究

利用同源重组将新城疫病毒(NDV)的F和HN基因、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因以及报告基因LacZ插入鸡痘病毒(FPV)的017株的复制非必需区,其中NDV的F、HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ是在早晚期启动子LP2EP2的控制下,大肠杆菌报告基因LacZ在晚期启动子P11的控制下。经过10轮蓝斑纯化获得了包含了NDV的F和HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒,称为rFPV-F/HN/gB/LacZ。经PCR方法证明rFPV-F/HN/gB/LacZ基因组中含有NDV的F基因、HN基因和ILTVgB基因;间接免疫荧光试验和Western-blot试验表明NDV的F、HN蛋白和ILTVgB蛋白在rFPV-F/HN/gB/LacZ感染的CEF细胞中获得表达。与亲本毒相比,重组病毒在病毒的复制和致鸡胚成纤维细胞的病变方面无显著不同。这证明了在鸡痘病毒载体的一个复制非必需区可以同时插入多个禽类病原的多个外源基因,为制备多价基因工程疫苗奠定了基础。     

表达新城疫病毒F48E8株血凝素—神经氨酸酶的重组鸡痘病毒的构建 …

在克隆和鉴定新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株血凝素－神经氨酸酶（ＨＮ）基因的基础上,应用分子克隆技术将ＨＮ基因导入鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５－１中启动子Ｐ７．５的下游,得到携带ＮＤＶ－ＨＮ基因的质粒ｐＦＧＨＮ１１７５－１。将此质粒ｐＦＧＨＮ１１７５－１以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株２８２Ｅ４株感染３￣４ｈ的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化３次,得到稳定的重组鸡痘病毒。用ＮＤＶ－ＨＮ基因特异     

共表达H5亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效地抵抗高致病性H5亚型禽流感病毒的基因工程疫苗,将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p11SH5ANA。将p11SH5ANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5ANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5ANA。通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒。经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性。用105PFU的rFPV-11SH5NA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体。初步的动物试验表明,该重组病毒能使经肌肉注射攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%,显示出一定的应用前景。     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。     

Construction and characterization of recombinant fowlpox virus co-expressing F and HN genes of newcastle disease virus and gB gene of infectious larygnotracheitis virus

The Fusion (F) and Haemagglutinin-Neuraminidase (HN) genes of Newcastle disease virus (NDV) and the glycoprotein B (gB) gene of infectious laryngothracheitis virus (ILTV) as well as a LacZ reporter gene were all inserted into a nonessential gene of fowlpox virus (FPV) 017 strain by homologous recombination. The NDV and ILTV genes were each under the control of a fowlpox virus immediate early/late promoter (LP2EP2), whereas the LacZ reporter gene expression cassette was regulated by a P11 late promoter. A recombinant FPV harboring the F, HN and gB genes as well as the LacZ gene, designated as rFPV-F/HN/gB/LacZ, was obtained after ten cycles of blue plaque purification. The presence of the NDV and ILTV genes was confirmed by PCR. The expression of the recombinant proteins in rFPV-F/HN/gB/LacZ was characterized by Western blot (F and gB proteins) and indirect immunofluorescence tests (F, HN and gB proteins). The results demonstrated that all four foreign proteins, which were encoded within a 10-kb gene fragment, could be expressed authentically and efficiently. Compared with the parental virus, rFPV-F/HN/gB/LacZ showed no obvious difference with respect to virus replication and cytopathogenic effects in the cell culture of chicken embryo fibroblasts (CEF). Overall, this study suggests that FPV can be a useful live virus vector for the expression of multiforeign genes against multiple avian pathogens.     

表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免？…

将将城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株融合蛋白基因导入鸡痘病毒（ＦＰＶ）插入载体ｐＥＧＦ１１７５－１的Ｐ７．５启动子下游,得到转移载体ｐＦＧ１１７５－１重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染ＦＰＶ２８２Ｅ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）。,经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒ｒＦＰＶ－ＮＤＦ。间接免疫荧光试验表明,ｒＦＰＶ－ＮＤＦ感染的ＣＥＦ中表达了ＮＤＶ的融合蛋白。用ｒＦＰＶ－ＮＤＦ免疫的ＳＦ