鹿茸角柄断面伤口无疤痕愈合过程中骨形态蛋白的表达及功能分析

为研究骨形态蛋白（bone morphogenetic proteins ,BMP）在鹿茸再生早期角柄断面伤口无疤痕愈合过程中的功能,本研究通过免疫组化技术对比分析了BMP 2 和BMP 4在正常皮肤及茸皮中的表达及分布差异,同时利用添加外源性蛋白分析了BMP 4对鹿真皮成纤维细胞和毛乳头细胞的影响。结果显示：(1)原代培养的真皮成纤维细胞表达波形蛋白阳性率几乎为100%;(2) BMP 2和BMP 4强烈表达于茸皮中新生毛囊的毛基质细胞中;(3) BMP 4可促进鹿真皮成纤维细胞向脂肪细胞转分化;(4) BMP 4可促进鹿真皮毛乳头细胞成团。以此推测BMP在鹿毛囊形成及伤口愈合过程中发挥重要作用。     

梅花鹿S100A4 基因的克隆及融合蛋白的表达

为了研究梅花鹿S100A4 (S100 calcium binding protein A4)基因在鹿茸生长过程中的作用。用RT-PCR 法
从生茸骨膜细胞总RNA 中克隆了梅花鹿S100A4 基因,在NCBI 中对基因序列进行比对;将完整的基因序列与逆
转录病毒表达载体pLEGFP-C1 重组,获得了重组质粒pLEGFP-S100;用脂质体法将pLEGFP-S100 与pVSV-G (被
膜载体)共转染包装细胞GP2 - 293,获得重组病毒上清液,感染角柄骨膜细胞后逆转录病毒携带的基因进入宿
主细胞。结果显示:S100A4 基因是一个相对保守的基因,与多个物种的匹配度达到90% ;重组逆转录病毒载体
pLEGFP-S100 可以形成重组逆转录病毒粒子,将S100A4 基因导入靶细胞,并表达S100A4 与GFP (Green fluorescent
protein)的融合蛋白。     

梅花鹿Fibulin 5 编码区cDNA的克隆及功能研究

为研究梅花鹿扣针蛋白5(Fibulin5, FBLN5)在鹿茸再生过程中的作用,本研究通过RT-PCR获得了梅花鹿FBLN5的cDNA编码区,并对其进行生物信息学分析。同时利用RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）下调了梅花鹿角柄骨膜致敏区（Potentiated pedicle periosteum, PPP）细胞中FBLN5基因表达,并研究了基因表达下调后PPP细胞条件培养液对HUVEC细胞增殖的影响。结果显示：(1) 梅花鹿FBLN5 cDNA编码区长1347 bp,编码448个氨基酸;(2) 生物信息学软件分析显示,梅花鹿FBLN5蛋白含有一个跨膜区,一段23个氨基酸的信号肽序列,vWA_Matrilin、cEGF和EGF_CA等重要的功能结构域;(3) 构建了梅花鹿FBLN5基因的RNAi重组质粒并获得了一条能有效下调目的基因效率达88.72%的靶序列pLVTHM-FBLN2,MTT结果显示PPP细胞FBLN5基因表达量下调后,所获细胞条件培养液可显著促HUVEC细胞增殖,推测FBLN5可能参与了鹿茸再生过程中的血管生成及稳态维持等过程。     

梅花鹿S100A4 基因RNAi 重组慢病毒载体的构建

本研究针对东北梅花鹿S100A4 基因筛选出若干条RNAi 靶位点,并利用NCBI 中的BLAST 工具去除脱靶情况,最终得到2 条高分靶位点。然后在T4 连接酶的作用下,将其与载体质粒pLVTHM 的酶切产物进行连接,并通过PCR 鉴定及测序筛选出阳性质粒。pLVTHM 阳性重组质粒与pMD2. G 及pCMV-dr8.91 共转染到293 T 细胞中。在倒置荧光显微镜下观察转染效果并进行收获病毒质粒。结果显示在转染24 h 后,在293 T 细胞中观察到了绿色荧光。本研究成功构建出针对梅花鹿S100A4 基因的慢病毒载体,为以后进一步研究S100A4 基因在鹿茸再生中的具体功能与机制打下了基础。