转基因动物在生物制药工业中的应用

简要论述了转基因动物的概念、制作方法及应用领域,回顾了转基因动物技术的发展及现状,分析了转基因动物与克隆动物的区别.就转基因动物在制药工业和生物医药领域中的国内外研究与开发应用情况进行了阐述,同时展望了转基因动物制药的发展前景及对社会的影响.     

花生ABI3同源基因的定位分析

ABSC ISIC AC ID-INSITIVE3(AB I3)、LEAFY COTYLEDON2(LEC2)和FUSCA3(FUS3)转录因子在种子发育过程中发挥着重要的调控作用。采用Northern杂交技术,用拟南芥AB I3保守的B3结构域部分序列作为探针分别与花生根、茎、叶、子叶RNA进行了杂交,同时也对花生根、茎、叶、子叶(含胚)组织切片进行了原位杂交,结果均显示只有在花生的子叶和胚中有杂交信号出现,表明花生中可能存在AB I3、FUS3和LEC2的同源基因,且它们只分布在花生的子叶和胚中。     

应用基因敲除快速构建大肠杆菌突变体改造脂肪酸代谢途径

【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.coli MG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除。【结果】获得了大肠杆菌β-氧化途径的缺失菌株△fadD、△fadE和△fadD-△fadE;脂肪酸合成途径缺失菌株△fabH、△fabF和△fabH-△fabF。敲除fadD和fadE对生长情况没有影响;敲除fabH后,生长速度明显减慢;敲除fabF对生长几乎没有影响。FadD、FadE及双敲缺失体的脂肪酸含量18.2 mg/L、20.0mg/L和19.2 mg/L,略高于野生型17.5 mg/L;FabH、FabF及双敲缺失体的含量分别为12.6 mg/L、15.2 mg/L和11.2 mg/L,明显低于野生型。【结论】在单基因突变体文库基础上,利用P1噬菌体转导、Red同源重组和抗性基因消除进行基因敲除,简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。     

3，4苯并芘对内皮祖细胞生物学功能的影响

目的研究3,4苯并芘（BaP）对人脐血来源的内皮祖细胞（EPC）生物学功能的影响。方法密度梯度离心法分离获取人脐血单个核细胞,采用贴壁培养法培养MNC中的EPC,通过Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）摄取实验和FITC标记的植物凝集素（FITC-UEA-I lectin）结合实验鉴定细胞。消化收集第3代细胞,分别采用细胞计数试剂盒（CCK-8）、黏附能力测定实验、Transwell小室法及Matrigel体外成血管试验观察BaP对EPC增殖能力、粘附能力、迁移能力及成血管能力的影响,并检测各组细胞培养上清液SOD含量。采用单因素方差分析及LSD-t检验进行统计学分析。结果采用贴壁培养法能成功培养出EPC;与正常对照组相比,BaP呈浓度依赖性降低EPC的增殖能力{正常对照组OD（1.02±0.04）显著高于BaP各组[BaP①组OD（0.66±0.04）,BaP②组OD（0.55±0.04）,BaP③组OD（0.35±0.05）,均P〈0.01],BaP染毒组间增殖能力差异亦有统计学意义（两两比较,均P〈0.01）};与正常对照组比较,BaP呈浓度依赖性降低EPC的黏附能力{正常对照组[（117.50±17.16）个/200倍镜]显著高于BaP各组[BaP①组（80.00±14.46）个/200倍镜,BaP②组（66.00±9.06）个/200倍镜,BaP③组（49.80±10.72）个/200倍镜,均P〈0.01],BaP染毒组间黏附能力差异亦有统计学意义（两两比较,均P〈0.05）};与正常对照组相比,EPC的迁移能力亦呈BaP浓度依赖性降低{正常对照组[（46.10±4.51）个/400倍镜]显著高于BaP各组[BaP①组（35.50±4.95）个/400倍镜,BaP②组（26.80±4.08）个/400倍镜,BaP③组（19.50±2.84）个/400倍镜,均P〈0.01],BaP染毒组间迁移能力差异亦有统计学意义（两两比较,均P〈0.01）};与正常对照组比较,EPC的成血管能力亦呈BaP浓度依赖性降低{正常对照组[（33.20±3.70）个/100倍镜]显著高于BaP各组[BaP①组（22.00±3.39）个/100倍镜,BaP②组（16.20±2.59）个/100倍镜,BaP③组（10.80±2.39）个/100倍镜,均P〈0.01],BaP染毒组间成血管能力差异亦有统计学意义（两两比较,均P〈0.05）}。同时细胞培养上清液中SOD的活力也呈BaP浓度依赖性地降低{正常对照组[（22.6±2.19）U/ml]高于BaP各组[BaP①组（15.94±1.68）U/ml,BaP②组（12.5±1.58）U/ml,BaP③组（6.9±1.55）U/ml,均P〈0.01],BaP染毒组间SOD活力差异亦有统计学意义（两两比较,均P〈0.01）}。结论 BaP体外诱导显著影响EPC的多种生物学功能,其机制可能与氧化损伤有关。     

咪唑斯汀治疗慢性荨麻疹临床疗效观察

目的：观察咪唑斯汀（皿治林）治疗慢性荨麻疹的疗效和安全性。方法：采用咪唑斯汀10mg／d,每日一次,对40例慢性荨麻疹患者进行了治疗,疗程4周,4级评分评价疗效,记录不良反应。结果：治疗4周后有效率为93．3％,随着用药时间的延长,其临床疗效明显增高。不良反应13例（17．3％）,大多表现轻可自行缓解,较重的不良反应1例（1．3％）,给予停药对症对处理后缓解。结论：咪唑斯汀（皿治林）是一种安全方便、疗效确实的治疗慢性荨麻疹的第2代新型抗组胺药物。     

冰冻切片技术在铁皮石斛显微结构上的应用

为了快速高效的观察兰科植物铁皮石斛的显微结构,利用光镜和改进的蔗糖保护--液氮速冻冰冻切片法,观察铁皮石斛根、茎、叶的显微结构。该技术方法是将铁皮石斛器官经过蔗糖磷酸缓冲液保护液处理后抽真空,再经过液氮速冻、包埋、切片、展片观察、染色以及拍照等步骤,制作出铁皮石斛根、茎和叶较完整的显微结构切片。研究结果表明,适合铁皮石斛根的最适条件为:蔗糖质量体积分数为8%、冷凝温度-25℃、切片厚度20μm;茎的最适条件为:蔗糖质量体积分数为16%、冷凝温度-20℃、切片厚度15μm;叶的最适条件为:蔗糖质量体积分数为4%、冷凝温度-20℃、切片厚度10μm。该研究在兰科植物显微结构观察和组织化学研究中将具有广阔的应用前景。     

拟南芥微丝加帽蛋白β亚基参与壳梭孢素诱导的气孔开放过程

气孔是植物响应外源信号,与环境进行水分和气体交换的门户。由外源信号引起的保卫细胞微丝骨架动态变化在气孔运动中发挥重要作用,但是具体的精确调节机制仍不清楚。微丝结合蛋白家族(ABPs) 是微丝动态组装最直接的调控者,它们的作用不容忽视。本文运用反向遗传学,以微丝结合蛋白—加帽蛋白 (CP) β-亚基 (CPB) 突变体cpb-3为实验材料,探究其在壳梭孢素 (FC)诱导气孔开放中的作用。结果发现:离体叶片干燥3 h,cpb-3突变体的叶片失水率为63.45%,明显高于野生型的48.99%。气孔开度测量及激光共聚焦显微镜观察发现,cpb-3突变体的气孔开放程度以及微丝动态重排对FC分子更敏感。气孔开度相比野生型增大了20% (P<0.05),含辐射状微丝排布的保卫细胞数量比例增幅达到58.3%,比对照组高出18.5%。此外,非损伤微测技术记录保卫细胞Ca²⁺、K⁺等跨膜运输动态,FC处理下,cpb-3突变体保卫细胞中Ca²⁺外流速度升至212.86 pmol cm^-2s^-1,野生型仅为68.76 pmol cm^-2s^-1,明显快于野生型。且K⁺内流也有相同表现。综上表明,微丝加帽蛋白CP的β亚基CPB可能通过调节保卫细胞微丝骨架动态重排以及离子流动,在FC诱导的气孔运动中发挥重要的作用。     

正交试验优化ELISA检测中TMB/HRP显色体系的研究

目的:建立ELISA显色体系的优化方法,优化TMB/HPR显色系统的反应参数.方法:首先采用单因素试验,研究显色体系中的缓冲溶液pH、TMB浓度、H<,2>O<,2>浓度、反应时间和温度对显色的影响,在此基础上,再进行5因素4水平的正交试验.结果:TMB/HRP体系的最佳工作条件:缓冲液pH为5.0,TMB浓度为2.5mg/ml,H<,2>O<,2>浓度为O.03%(V/V),反应温度为30～50℃,反应时间为10min.结论:优化的TMB/HRP最佳反应条件,可以满足一般反应的要求,所建立的TMB/HRP体系的优化方法也适用于其它ELISA显色系统的优化.     

用线性梯度平板准确测定药物敏感性和分离抗药性菌株

菌群在药物的最低抑菌浓度附近的动力学过程是抗生素药理学研究的核心问题.建立一种能确定精确的MIC且又能准确分离抗药性菌株的方法,是目前临床对药敏实验新的要求.根据Fick扩散定律制备了线性梯度平板：将15mL含适当浓度恩诺沙星的琼脂培养基在9cm培养皿中倾斜凝固,刚好覆盖整个平板底面,然后水平放置,再在其上层加入同样体积的无药琼脂培养基,凝固12h后,药物浓度达到扩散平衡而呈均匀连续线性梯度.通过实测验证药物浓度在平板表面呈线性梯度分布.将待检E.coli菌群均匀涂布在梯度平板上,培养12h后,随恩诺沙星浓度提高依次形成连续密集小菌落区和离散大菌落区,根据两区域的分界线可以确定菌群自然形成的真实的MIC,与常规药敏实验方法测定结果一致.大菌落重新涂布高梯度平板,分界线显著上升,并检测出抗药性基因突变,表明该方法很容易筛选出菌群中的抗药性菌株.梯度平板可以方便地呈现整个菌群在MIC附近的动力学过程和遗传生理变化,并预警该抗生素使用后可能出现的抗药性,从而指导临床抗菌药物的选择和使用.     

Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少。本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型。将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3GUL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体。运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF。遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达。感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响。限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确。病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高。在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白。这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达。Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间。这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础。