以梯度平板法改进药敏试验方法及其药物浓度质量控制

药敏试验是临床选择敏感抗生素的精确检测工作,其成败在于质量控制的可靠性和最低抑菌浓度(MIC)的精确性、前瞻性.本文结合质控试验和药敏试验对梯度平板法进行验证,梯度平板法所测得的MIC与微量肉汤稀释法和琼脂稀释法测得的MIC结果一致,且因为线性设置的药物浓度,MIC更加精确,能推算抗菌药物的原始浓度,更好地保证质控试验的可靠性.同时,按照美国临床实验室标准委员会或欧盟药敏试验委员会的敏感(S),中介(I)以及抗药(R)范围标准设置0-S,S-R,R-8R这样3个线性梯度,首先判断菌株敏感性范围,然后精确测定细菌群落的MIC值,并能有效分离出抗性菌株,预警该抗生素使用后可能出现的抗药性,进而指导临床抗菌药物的选择和应用.梯度平板的主要困难在于手工制备的繁琐和不稳定性,如果自动化生产即用型梯度平板,将便利临床药敏试验,改进抗药性筛选技术.     

抑制E.coli的SOS应答对恩诺沙星抗药性的影响

通过敲除SOS应答启动蛋白基因rec A,探讨SOS应答对E.coli恩诺沙星抗药性的影响,并体外评价Rec A抑制剂和恩诺沙星联用对细菌协同抑制作用的影响.利用Red重组系统,构建E.coli ATCC 25922的rec A缺失菌株E.coli ATCC 25922/?rec A;在恩诺沙星压力下,利用荧光定量PCR测定SOS应答系统相关基因rec A和umu C表达量的变化.用微量肉汤稀释法测定恩诺沙星等常用抗生素对两个菌株的MIC变化;利用梯度平板法测定恩诺沙星对两个菌株抗药性变异的影响;合成Rec A抑制剂,并评估其与恩诺沙星联合抑制E.coli生长及其抗药性的作用.结果表明,E.coli ATCC 25922/?rec A菌株对恩诺沙星的最低抑菌浓度值降低至原始菌株的1/8;经药物处理后,在梯度平板上,rec A缺失菌株较野生型不易产生抗药性;荧光定量PCR表明,rec A缺失菌株或在Rec A抑制剂作用下,SOS应答系统受到一定的抑制.敲除rec A,使菌株对恩诺沙星的抗药性和抗药率均明显降低;Rec A抑制剂在一定程度上能抑制SOS应答,起到协同抑菌作用.     

聚乙二醇小檗碱液对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制作用

目的 明确聚乙二醇小檗碱液在琼脂培养基表面的抑菌特点,及其对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株、抗生素敏感菌株与多重耐药菌株生长的抑制作用,研究评价药物在皮肤黏膜表面的抑菌作用的合理实验方法.方法 以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌(标准菌株、抗生素敏感菌株和多重耐药菌株)为研究对象,用常量肉汤稀释法测定聚乙二醇小檗碱液的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC);用平皿琼脂培养法和试管肉汤培养法测定不同浓度聚乙二醇小檗碱液的抑菌作用.结果 在不同浓度的聚乙二醇小檗碱液的作用下,在琼脂培养基表面上或肉汤培养基中细菌的生长受到明显抑制,抑制作用与小檗碱浓度正相关,且对抗生素敏感菌株和多重耐药菌株的抑制作用差异无统计学意义;聚乙二醇小檗碱液在平皿琼脂表面和试管肉汤中对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌抑制100％菌株的浓度分别为1 500和375 mg/L、1 500和375 mg/L.聚乙二醇小檗碱液在琼脂培养基表面的抑菌作用明显低于在肉汤培养基中的抑制作用,在琼脂培养基表面的抑菌浓度是肉汤培养基中的抑菌浓度的4倍.并且金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌之间差异无统计学意义.聚乙二醇小檗碱液必须达到肉汤培养基中4倍以上浓度时,才能获得抑制100％细菌在琼脂培养基表面生长的效果.结论 高浓度的聚乙二醇小檗碱液可以抑制皮肤黏膜表面的细菌,包括抗生素耐药菌株的生长;皮肤黏膜表面应用聚乙二醇小檗碱液的适宜浓度为1 500 mg/L.琼脂培养基法适用于评价药物在皮肤黏膜表面的抑菌作用.     

急性肠道传染病实验手册(续一)——(腹泻病控制计划——CDD83.3)

<正>4、抗菌药物敏感性试验 下法常用于对抗菌药物的抗性试验。 稀释试验:为定量测定抗菌素活性,可把抗菌素稀释入肉汤或琼脂培养基中,然后接种试验菌株。过夜培养后能阻止活菌生长的抗菌素最小浓度,作为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。 扩散试验:在均匀混入试验菌株的琼脂培养基上放上抗菌素浸泡过的纸片或药片。在纸片周围生长的细菌受到抑制,抑制距离大小同该菌的敏感性相关,从而形成了抗菌药物的浓度梯度。     

两株高效相思根瘤菌的抗药性研究及其质粒组成分析

目的:研究相思根瘤菌质粒与其抗药性之间的关系。方法:研究了相思根瘤菌MZ和AJ018在含不同浓度的抗生素的固体培养基和液体培养基的生长情况,并用碱裂解方法对其质粒组成进行检测。结果:两菌株对链霉素和卡那霉素均无抗性,而对其它抗生素都有不同程度的抗性。MZ菌株对实验中的氯霉素、氨苄青霉素、四环素三种抗生素的耐受范围与最大耐受值都比AJ018强,当平板培养基中氨苄青霉素、四环素、氯霉素的终浓度分别为250μg/ml、75μg/ml、150μg/ml时,AJ018在平板上无菌落生长,当三种抗生素终浓度分别为800μg/ml1、50μg/ml、400μg/ml时无菌落生长。两菌株都含有一个大约50kb的质粒。     

构建大肠杆菌药敏试验新方法的探索

基于对大肠杆菌CVCC249菌株生长动力学过程的分析表明, 导致药敏试验结果不确定性的原因主要是由于不能测计“药物浓度与菌群数量的比值”及“药物浓度及其作用时间的复合作用”对菌群生长动力学过程的影响所致. 依据菌群在一系列不同浓度的庆大霉素及其作用时间下生长受到抑制的动力学过程分析和基于差分方法, 即用简单的差分计算代替复杂的微分方程的数值解法的应用, 提出了一个药敏试验的新方法: 用菌群浊度值的净增量以消除休止细胞存在的影响后, 以菌群浊度数列递推系数值的变化, 表征药物对菌群增殖的影响, 并结合用等值线图直观显示和分析药物浓度及其作用时间复合作用的方法. 抗菌药物的抑菌率可表征为药物浓度及其作用时间的复合函数的动态变化, 表明一类抗菌药物对某一菌株抑菌率的时间或浓度依赖性, 取决于其浓度和存在时间的复合效应. 用属于不同抑菌作用机理类型的恩诺沙星、左氧氟沙星和头孢曲松钠进行对比测试, 检验了这一新方法的有效性.     

恩诺沙星对4种水产致病弧菌的抑杀菌效应

采用二倍稀释法测定恩诺沙星对溶藻弧菌、最小弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌4种12株菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),结果表明:恩诺沙星对12株弧菌的MIC为0.1?0.8 mg/L,MBC为0.4?3.2 mg/L。在此基础上,从每种菌中选取一株对恩诺沙星较为敏感的菌株,研究恩诺沙星不同药物浓度(1 MIC、2 MIC、4 MIC)对4种弧菌的杀菌动力学和抗菌后效应(PAE),结果显示:各浓度恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R菌株均有较强的杀菌作用,而对哈维氏弧菌M071202-H、创伤弧菌Q050723-C、最小弧菌H010911-Z等3菌株却表现出了低浓度抑菌、高浓度缓慢杀菌的作用。恩诺沙星的抗菌后效应PAE与药物浓度及细菌与药物的接触时间成正相关,恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R的PAE最长,对哈维氏弧菌M071202-H的PAE最短。     

1株新分离的人两歧双歧杆菌耐药性研究

目的研究新分离的人两歧双歧杆菌对11种抗生素的耐药性。方法采用琼脂扩散纸片法测定人两歧双歧杆菌对11种抗生索的敏感性,通过在双歧杆菌培养基中添加不同浓度的抗生素来确定MIC值。结果该菌株对β-内酰胺类、大环内脂类和利福平非常敏感．对氨基糖苷类、黄胺类表现出较强抗性。结论该菌株对11种抗生索的药物敏感性与国内外其他文献所报道的结果一致。但该菌株带有一22kb大小的天然质粒。需进一步研究质粒与其耐药性的关系。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅳ.高产变异株纤维素酶合成调节的变化——酶活提高原因的初步分析

拟康氏木霉纤维素酶高产变异株EA_3-867和N_2-78在合成培养基琼脂平板和马铃薯葡萄糖琼脂平板上菌落明显缩小,生长变慢。但在蛋白胨酵母膏琼脂平板上,小菌落恢复成大菌落,生长速度同野生型菌株一致。EA_3-867和N_2-78在不同液体培养基中纤维素酶活力均显著高于野生型菌株1096和木_3。洗涤菌丝体的诱导测定也证明高产变异株的纤维素酶诱导活性有明显的提高。变异株和野生型菌株洗涤菌丝体诱导形成的纤维素酶组分,从聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱判断,未见明显差异,仅变异株中代表纤维素酶活性的蛋白带显著加深。高产变异株纤维素酶产量的增加是由于菌株对诱导剂敏感性的增加和对降解物阻遏敏感性的减弱。     

枯草芽孢杆菌抗药性突变株的筛选

从土样中分离出枯草杆菌,采用梯度平板法,利用链霉素,氯霉素,红霉素,四环素四种抗生素,对自然界中和经过紫外线诱变的菌株进行了抗药性突变株的筛选,我们发现分离出自然状态下的枯草杆菌没有抗药性,而经过紫外线诱变后,能够筛选出对链霉素具有抗药性的菌株.     

几种中药单体和抗生素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的体外抑菌活性研究

考察没食子酸等6种中药单体和诺氟沙星等3种抗生素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的体外抑菌活性及其联合抑菌作用。通过琼脂扩散法测定受试物的抑菌作用,用微量二倍稀释法测定受试物最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,用棋盘法考察受试物的联合抑菌作用。6种中药单体中没食子酸和槲皮素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌抑制作用较强,抑菌圈均达到20 mm以上,没食子酸对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的MIC和MBC均为250 g/mL;槲皮素对嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为500 g/mL,对温和气单胞菌的MIC和MBC分别为250和500 g/mL;而大黄素甲醚等4种中药单体无明显的抑菌作用。嗜水气单胞菌及温和气单胞菌对诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考等抗生素均极敏感。在联合药敏试验中,没食子酸与恩诺沙星或氟苯尼考、槲皮素与氟苯尼考联合用药对嗜水气单胞菌具有相加抑菌作用;没食子酸与恩诺沙星联合用药对温和气单胞菌具有协同抑菌作用,没食子酸与诺氟沙星或氟苯尼考、槲皮素与氟苯尼考联合用药对温和气单胞菌具有相加抑菌作用。没食子酸和槲皮素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌具有显著的抑制作用,二者与恩诺沙星、诺氟沙星、氟苯尼考等抗生素联合应用具有相加或协同作用,有助于降低抗生素的用量及残留。       

动态分析抗菌作用的新方法

最低抑菌浓度(MIC)是表征抗菌药物对细菌生长抑制最终效应的常规方法,不能描述抑菌作用的时间过程,药敏试验也不适用于高抗药性水平菌株的治疗方案确定.因此本文提出了一个普适性的新药敏试验方法.不同接种量的质控菌株Escherichia coli ATCC 25922和临床高抗药性水平菌株E.coli BBZ在不同系列浓度的6种抗菌药物(环丙沙星、氨苄西林、头孢噻呋、阿米卡星、硫酸黏菌素和多西环素)作用下,37℃下培养1200 min,连续检测时间序列点的光密度值A600作为反应变量,以相对抑菌效应(RIE=((a.b)/a)×100%)表征抑制效应,进而用等效线图表征药物浓度和时间协同抑制效应的动态过程,量化了浓度依赖型和时间依赖型,细化不同菌株对药物敏感性的差别.由此得到,达到最大抑制效应时,需要的最低药物浓度和时间,以及增大药物浓度或延长反应时间对抑制效应的影响,这正是临床用药最需要的信息.此外,大接种量下最大抑菌效应很低,表明不适合治疗.本方法为防治高抗药性菌株感染提供了药敏试验方法,也有益于促进新药研发药敏检测方法的改进.最后提出适于临床应用的、快速定性显示药物敏感性的方法的建议.     

126株淋病奈瑟菌耐药性分析及其所致感染的中西医结合治疗

目的研究近几年来淋病奈瑟菌(简称淋球菌)对抗生素的敏感性,探讨中西医结合治疗的有效性。方法对我科从2000年1月～2007年6月收治保存的126株淋球菌分别用纸片扩散法和快速药敏测试法进行15种药物的药敏检测,并用头孢曲松合并中药治疗。结果用快速定量药敏检测法测定的最小抑菌浓度(MIC)与用K-B法基本相符。对环丙沙星的耐药率为40%,1.50%的菌株耐大观霉素(MIC≥64μg/ml);所有菌株均对头孢曲松敏感。中西医结合治疗所有病例均获得痊愈。结论头孢曲松药物敏感性无明显变化,6年间未发现耐药菌株;环丙沙星耐药性显著上升。中西医结合在淋病治疗中有效可行。     

大肠杆菌群体的生理异质性对药敏实验的影响

E. coli CVCC249分批培养的过程根据菌群瞬时生长速率的变化分为加速生长期、恒速生长期、减速生长期和衰亡期4个阶段. 各阶段分别取样, 测定抗生素浓度-杀菌曲线(concentration- killing curve, CKC), 结果表明菌群的生理异质性导致菌群个体间的药物敏感性不同, 总体呈现正态分布. 检测表明各阶段中菌群的核酸、蛋白质含量和脱氢酶活力都有明显差别, 这种生理异质性导致各阶段菌群对药物敏感性的差异. 以加速生长期菌群的CKC曲线为参照, 对于庆大霉 素, 恒速生长期和衰亡期菌群敏感性增强; 对于恩诺沙星恒速生长期反而减弱, 其他阶段差别不大. 这是常规药敏实验方法难以显示的, 表明对不同生理状态菌群的药敏实验测定结果可深入反映出药物的杀菌机理. 这有助于常规药敏实验方法的改进, 并可为抗菌药物的合理使用提供理论支持.     

梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变筛选模型的初步研究

本文通过梅岭霉素 (Meilingmycin)产生菌南昌链霉菌NS 4 1 80菌株孢子对 6种抗生素敏感性测定 ,采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含致死浓度链霉素的高氏平板上。然后从抗药性突变标志菌株中进一步筛选梅岭霉素高产菌株。在 150 0多个抗药性突变株中通过初筛获得了比诱变出发菌株的产素能力提高 50 %以上菌株。通过诱变剂量分别与抗药性突变率和突变株产素产量的变势统计分析表明 ,菌株抗药性突变与产素突变密切相关 ,产素突变的EMS诱变剂量高于抗药性突变诱变剂量 ,在 0 .0 3mol/LEMS剂量作用下 ,菌株致死率为 99.4 3% ,抗药性突变率为 0 .0 4 4 0 % ,建立了梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变推理性筛选模型。为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试 ,并有助于其它链霉菌属的抗生素产生菌育种研究。     

表征抗菌药物抑菌动力学的等效线药敏试验方法

以抗菌药物作用浓度与时间对抑菌率的协同作用,改进通行的药敏试验方法.采用Bioscreen全自动生长曲线分析仪,在线测定连续时间、连续固定浓度抗菌药物作用下禽致病性大肠杆菌BBZ6-3g在MHB中生长量(A600),建立了抑菌动力学检测体系.用Sigma plot构建以相对抑菌率RBR=1-At-i/At-0对抗菌药物浓度和作用时间的等效线图.等效线图全面地反映了药物浓度和时间对抑菌量的影响过程及趋势,兼具二维曲线的量化和三维曲面的直观特点,而且RBR通过归一化处理,消除了细菌群体的自然增殖的本底、不同接种量、不同抗菌药物的差异影响,可以直接比较不同抗菌药物的抑菌率,专门比较浓度和时间对抑菌率的影响.抑菌作用本质上是抗菌药物抑制细菌对营养物质的利用效率和程度,与细菌死亡是不同但是相关的过程.0.5 RBR为传统的目测最低抑菌浓度(MIC),以此为界,等效线图可以直观地分为3部分:分化区(0.5纵向等效线以左,全部浓度)、生长区(0.5以上的等效线)、抑菌区(0.5纵向等效线以右延伸且0.5以下的等效线).分化区边界时间在100~300 min,因此传统的药敏试验以8~12 h的终态来判断抑菌率,确定MIC是可靠的;抑菌区和生长区之间的等效线疏密,实际上是浓度依赖性和时间依赖性的依据.抑菌动力学检测体系和反映RBR的等效线图,改良了传统药敏试验方法,有望分析不同接种量对抑菌率和菌群变异的影响、不同浓度的抗菌药物后效应(PAE),比较不同菌种或不同抗药性水平菌株的抑菌动力学.     

分枝杆菌简化琼脂培养基的研究

报道三种组分简单、制备方便的简化琼脂培养基.试验结果表明:7个标准菌株在简化琼脂培养基309A和309C上的生长速度和数量均相似或优于改良罗氏培养基和92号土豆汤琼脂培养基.简化琼脂培养基309C和309A可用于结核杆菌分离和药敏试验.     

具有抑制单胺氧化酶作用的干酪乳杆菌JH-23的药敏性研究

采取纸片琼脂扩散法对具有抑制单胺氧化酶作用的干酪乳杆菌JH-23进行抗生素的敏感性测定.考察了不同菌液浓度、培养时间和接种方式对药敏性实验的影响,在此基础上建立了其对12类30种抗生素的药敏谱,以进一步全面评估该益生菌的安全性.     

5种抗生素对4株化脓隐秘杆菌的最小杀菌浓度测定

目的测定诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、安普霉素和庆大霉素5种抗生素对林麝化脓隐秘杆菌的最小杀菌浓度,为选择治疗林麝脓肿病的有效药物提供指导。方法将菌液与不同浓度的抗生素混合作用30min,再加入中和剂作用10min,吸取300mL作用液均匀涂布在胎牛血清培养基上,38℃培养48h,观察并记录。结果 5种抗生素对化脓隐秘杆菌的最小杀菌浓度不一致,对4株菌杀菌效果相对较好的药物为环丙沙星(CIP),但对TP1需要较高浓度(128μg/mL)。结论喹诺酮类抗生素虽然抑菌效果较明显,但要完全杀死化脓隐秘杆菌却需要较高浓度,这很可能与化脓隐秘杆菌菌膜的存在有关。到目前为止,治疗林麝脓肿病的首选药物为喹诺酮类抗生素,尤以环丙沙星效果最佳。     

大熊猫中分离出一株肠道杆菌及其初步鉴定

大熊猫出血性肠炎病原,至今未见报道。对此,1988年5月作者作了初步探索。材料与方法一、标本:采自成都市动物园一疑似患出血性肠炎大熊猫的肛拭子。二、培养基:S—S琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板。三、分离培养和鉴定:将肛拭子在床旁分别接种在S—S琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板培养基。24小时后挑选可疑菌落作革兰氏染色及荚膜染色、生化试验、动物试验和药敏试验。结果在S—S平板和伊红美蓝平板上生长的细菌几乎是纯种。经形态学、生理学等方面的鉴定,确定为肠道杆菌中克雷伯氏菌族中的产气杆菌。该菌对先锋铋(Cefoperazone),先锋霉素等敏…