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1.
2.
【目的】克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 并进行酶转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究。【方法】PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand, 构建表达载体pET24a(+)-Pand, 转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3), 对重组菌进行诱导表达, 表达产物经DEAE离子交换层析和G-75 分子筛层析纯化后进行酶学性质研究, 然后进行酶转化实验, 说明底物和产物对酶转化的影响。【结果】重组菌SDS-PAGE分析表明Pand表达量可达菌体总蛋白的50%以上, AccQ·Tag法检测酶活达到94.16 U/mL。该重组酶最适反应温度为55 °C, 在低于37 °C时保持较好的稳定性, 最适pH为6.0, 在pH 4.0?7.0范围内有较好的稳定性。酶转化实验说明: 底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸对转化反应均有抑制作用; 实验建立了较优的酶转化反应方式, 在加酶量为每克天冬氨酸3 000 U时, 以分批加入固体底物L-天冬氨酸的形式, 使100 g/L底物转化率达到97.8%。【结论】重组L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中获得高效表达, 研究了酶转化生产β-丙氨酸的影响因素, 为其工业应用奠定了基础。 相似文献
3.
重组大肠杆菌表达铜绿假单胞菌溶血性磷脂酶C 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]构建产溶血性磷脂酶C (Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli菌株,并初步优化其发酵条件.[方法]首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株产磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)活性较高的菌株,命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)41;进一步以P.aeruginosa 41基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增获得溶血性磷脂酶C(PLCH)基因,构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3);筛选转化子并检测PLC活性和溶血能力,并初步优化其发酵条件.[结果]成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) /pET28a-plcH;在硼砂卵黄平板上对重组菌进行PLC活性测定,显示重组菌有明显的磷脂酶C活性;在哥伦比亚血琼脂平板上对重组菌进行溶血性试验,表明PLCH具有较强的溶血活性;初步优化摇瓶发酵条件为:5%转接量,37℃、200 r/min下培养4h添加IPTG至终浓度为0.9 mmol/L,转为25℃、150 r/min诱导培养14 h;优化后重组菌的酶活可达到722.89±0.47 U/mL.[结论]本文成功构建了一株产溶血性磷脂酶C活性较高的重组大肠杆菌菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到了722.89±0.47 U/mL,本实验在国内首次实现了铜绿假单胞菌来源的溶血性磷脂酶C基因在大肠杆菌的胞内表达,该研究为研究磷脂酶C产业化奠定了一定的基础. 相似文献
4.
锌指核酸酶技术在基因定点修饰中具有效率高和特异性好等特点,并成功应用于数十种生物。目前,该技术是否能应用羊上尚未报道。为了敲除转基因山羊标记基因 (EGFP),构建了一对针对EGFP外显子上的锌指核酸酶表达载体,将其电转染至转EGFP基因胎儿成纤维细胞中,研究了锌指核酸酶突变EGFP基因的效率和方式,利用基因显微注射单细胞获得获得的转基因 (EGFP) 细胞系作为锌指核酸酶的靶细胞。结果显示,通过锌指核酸酶的突变作用,转染后的细胞发绿色荧光比例下降,测序结果显示在EGFP外显子中插入1个碱基G,导致编码EGFP基因的阅读框改变,从而起到基因突变的作用。结果表明,文中构建的锌指核酸酶对EGFP基因有突变作用,可以为以后获得无标记基因供核细胞进行体细胞核移植生产克隆羊奠定基础。 相似文献
5.
6.
基于文献计量分析的区域生态安全研究热点与趋势 总被引:4,自引:0,他引:4
生态安全是生态学研究的热点议题,近年来国内外对生态安全领域相关研究力度不断增大。文章以WEB OF SCIENCE数据库和中国期刊全文数据库(CNKI)中期刊论文为数据源,从文献计量的角度,利用Excel统计论文年度发文量,通过Bibexcel得到高频词共词矩阵,导入Ucinet和Netdraw得出共现网络可视图,最后利用SPSS对关键词进行聚类分析,以探究区域生态安全研究热点和趋势。研究表明:(1)区域生态安全研究发文数量基本逐年递增,自2012年起进入快速增长阶段。(2)国内外区域生态安全的研究内容具有较大差异。国外更注重在气候变化背景下生态安全与可持续发展的关系研究;国内更加关注生态安全空间规划、生态文明建设等基本理论与生态安全实证检验。(3)共现网络可视中的关键词food safety、environment和climate change与生态安全、生态文明建设和生态保护红线一定程度上成为当前研究的热点。(4)国内外区域生态安全研究对象和研究尺度均存在较大的差异。国外主要以极端贫困国家和发展中国家为研究对象,研究尺度涉及地区、国家甚至全球;国内主要以区域为研究对象,研究尺度集中于中尺度。综上,目前区域生态安全研究的热点是区域生态安全评价及其影响因素、生态文明建设战略和可持续发展研究等,未来生态安全的研究趋势将集中于生态安全空间演变、国际与区际间安全关联和安全对策等。 相似文献
7.
地衣芽胞杆菌有效的基因编辑工具有限,为了拓展和丰富其基因编辑手段,在地衣芽胞杆菌中构建一个抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并通过敲除α-淀粉酶基因amyL、蛋白酶基因aprE及敲入外源透明颤菌血红蛋白基因vgb对该系统进行初步验证。首先以温敏质粒pNZT1为载体分别构建amyL和aprE基因敲除质粒pNZTT-AFKF和pNZTT-EFKF,两个敲除质粒各自包含针对目标基因的同源臂、抗性基因及同向的FRT位点;将敲除质粒转化地衣芽胞杆菌并经过两次同源交换过程实现目标基因的敲除;最后导入一个FLP重组酶表达质粒通过FLP/FRT系统的重组作用介导抗性基因的回收。为进一步验证本系统的实用性及编辑效率,构建了包含透明颤菌血红蛋白编码基因vgb表达盒及基因组丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB敲除盒的重组质粒pNZTK-PFTF-vgb,并以此进行外源基因vgb在基因组上的定向敲入。结果显示,成功敲除amyL及aprE并回收了抗性标记卡那霉素基因,敲除后淀粉酶活和蛋白酶活分别减少95.3%和80.4%;vgb基因成功整合入基因组pflB位点并回收了抗性标记四环素基因,并利用荧光定量PCR技术检测到vgb的整合表达。文中首次建立了一个适用于地衣芽胞杆菌的、抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并进行了基因敲除及基因敲入验证,为地衣芽胞杆菌遗传改造提供了良好的方法参考。 相似文献
8.
笔者前期研究发现经干旱胁迫处理后的花生叶片水势与其籽仁含油率呈显著正相关。文中对羟脯氨酸作为水势(渗透压)调节物质用于离体定向筛选花生高油突变体及培育花生新品种进行了研究。以花生品种花育20号胚小叶作为外植体,平阳霉素作为诱变剂添加于体胚诱导培养基上进行离体诱变培养。形成的体胚转移到添加6 mmol/L羟脯氨酸(培养基水势为-2.079 MPa)的体胚萌发和再生培养基上诱导体胚萌发成苗,同时进行高油突变体定向筛选。再生小苗经嫁接移栽田间,从再生植株后代中获得了132份含油率55%以上的高油突变体,其中27份含油率超过58%,2份超过60%。再生植株后代结合系谱育种法育成了高产高油花生新品种宇花9号,在辽宁省花生新品种备案试验中,籽仁产量比对照品种增产14.0%,并通过了国家非主要农作物品种登记。宇花9号含油率达61.05%,比亲本花育20号高11.55个百分点,是目前国际上含油率最高的花生品种。本研究结果表明,利用离体诱变、培养基低水势定向筛选及其再生植株后代结合常规育种法选择是定向培育高油花生品种的有效方法。 相似文献
9.
转录因子CNR(Colourless non-ripening)在果实的发育和成熟过程中起重要作用。目前关于番茄转录因子CNR的研究主要集中在转录水平,然而蛋白水平才是CNR发挥作用的水平。通过对CNR进行原核表达和纯化,并制备CNR的多克隆抗体,在蛋白水平上确定番茄转录因子CNR的表达模式。结果表明:pET-CNR重组载体具有正确的读码框,且与已发表的番茄CNR编码序列完全一致,并且在27 kD处有CNR蛋白表达,证明pET-CNR原核表达载体构建成功。诱导剂IPTG的最适宜浓度为1.0mmol/L,当用咪唑浓度为500 mmol/L的洗脱缓冲液洗脱层析柱时得到单一的CNR蛋白,并以此作为抗原免疫小鼠,制得效价高且特异性好的CNR蛋白多克隆抗体。最后研究不同成熟时期番茄果实CNR蛋白的表达模式,结果发现转录因子CNR在番茄果实的破色期起重要作用。 相似文献
10.
以盐单胞菌S62 β-半乳糖苷酶为研究对象,探究其合成低聚半乳糖效率。为了提高低聚半乳糖产率,对反应条件进行了优化,并以反应温度、pH、加酶量、底物浓度为考察对象进行正交试验,得到最优反应条件:反应温度40℃,pH 7.0,加酶量50 U/mL,底物质量浓度300 g/L。反应6 h时可获得最大低聚半乳糖产率(41.91±0.27)%,乳糖消耗率为(82.47±0.38)%。反应4~8 h内低聚半乳糖产率都维持在40%以上,此时乳糖消耗率均在80%以上,在提高乳糖利用率的同时实现了低聚半乳糖的高产,有利于降低生产成本,为低温S62 β-半乳糖苷酶工业化应用奠定了基础。 相似文献