一个RNAi载体上反向重复片段的测序策略

相邻的反向重复DNA片段有形成单链内二级结构的倾向,属于一种测序困难的DNA模板。解决RNAi载体插入的反向重复片段的测序问题,为该类载体正确性的测序验证奠定基础。采用常规分子克隆方法构建表达小麦TaATG2串联反向重复片段的RNAi载体,设计2种策略对经菌落PCR初步鉴定的载体进行测序验证:一种是以完整的载体质粒为模板进行测序;另一种是先对载体进行酶切处理,切除反向重复片段中的一个后对保留另一个片段的线性载体进行测序。结果表明,第一种测序策略受到串联反向重复片段形成的单链内部二级结构的影响,测序信号在反向重复片段处出现衰减或乱峰,无法读取序列。第二种测序策略排除了2个反向重复片段之间的干扰,保留在载体上的片段测序信号清晰,序列准确。采用酶切切除一个片段后进行测序的方法,经过2次酶切和2次测序可以有效地对载体上的2个反向重复片段分别进行序列测定,进而确认构建载体的正确性。     

担载血管生长因子的乳液法纤维用于血管再生的研究

目的:制备担载血管生长因子(VEGF)的乳液法静电纺丝纤维膜,对其开展一系列表征,从而研究其血管再生的潜能。方法:通过W/O乳液法制备担载VEGF的静电纺丝纤维膜,并对其形态、力学性质进行表征。用VEGF ELISA分析方法对其体外释放动力学进行研究。运用CCK-8法检测乳液法静电纺丝纤维膜中VEGF的活性变化。结果:乳液法静电纺丝纤维膜呈现连通的三维网状结构,平均直径为1μm,模拟了细胞外基质(ECM),最大拉伸应力为3.03±0.66 M Pa,具有良好的抗拉伸能力,能够支持细胞的生长。乳液法纤维膜中VEGF在体外累积释放了14天,总释放量超过20000 pg,达到血管再生的有效浓度。CCK-8结果显示,乳液法纤维膜中的VEGF仍然保持较高的蛋白活性。结论:担载VEGF的乳液法静电纺丝纤维膜能够缓释出活性的蛋白,具有血管再生的潜能。     

一类双线性生态系统的无源控制

研究了一类广义双线性系统的无源控制问题,利用广义Lyapunov函数和线性矩阵不等式,给出了广义双线性系统无源且零解渐近稳定的充分条件,并在一定条件下得到存在状态反馈控制器,使得闭环系统无源且零解渐近稳定的充分条件,同时给出相应的控制器构造方法。     

液体培养蛹虫草虫草素和腺苷的代谢量

为提高虫草素和腺苷的代谢量,用高效液相色谱法作检测手段,以二者含量为检测指标,对液体培养的氮源种类、氮源水平、碳源水平、动态变化、培养体系的虫草素及腺苷含量和总量进行研究,结果表明:不仅蚕蛹粉,豆粕和豆粉也是很好的氮源;培养液以3%氮源、4%碳源为佳;振荡培养8d,培养液中虫草素总量是菌丝体中虫草素总量的6倍多;振荡培养7~9d,可使每瓶培养物的虫草素和腺苷总量达到10mg以上。     

基因组重排选育胸苷磷酸化酶高产菌株

以短乳杆菌为研究对象,通过基因组重排技术选育胸苷磷酸化酶高产菌株。首先采用紫外复合诱变筛选出EA42、EB27作为基因组重排育种的亲本并制备成原生质体,分别采用紫外照射50min和60℃水浴加热60min双亲灭活原生质体,然后用质量分数40％PEG6000,30℃恒温诱导融合10min进行基因组重排。经过3轮基因组重排育种,成功选育出3株胸苷磷酸化酶高产菌株,其中菌株F3-36在菌体发酵量提高的前提下,进行5次传代测试其胸苷磷酸化酶活均在2．500U／mg湿菌体,比原始菌株酶活提高了260％。     

屎肠球菌的临床分布与耐药性分析

目的了解医院屎肠球菌的临床分布和耐药情况,为临床抗感染的预防与治疗提供参考。方法回顾性分析1999年1月至2011年12月临床标本中分离的1161株屎肠球菌;用WHONET5．6软件分析耐药率变迁。结果临床分离的1161株屎肠球菌,在同期分离的1944株肠球菌属中占59．72％。主要分离自尿液和血液,分别占40．91％和26．87％;主要分离自外科病区、内科病区、ICU和儿科病区的菌株,分别占29．37％、25．15％、13．95％和13．53％;屎肠球菌对多种抗菌药物耐药,对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺的耐药率较低,分别为1．04％、0．94％和1．85％。结论屎肠球菌在临床的分离率逐年增加,已成为医院内感染的主要病原菌之一,其多药耐药和高耐药现象相当严重,目前万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺仍然是治疗肠球菌属引起感染的有效药物。     

沙眼衣原体感染诱导小鼠生殖道局部促炎性细胞因子的表达情况

建立小鼠生殖道沙眼衣原体感染模型,观察小鼠生殖道局部促炎性细胞因子的表达。将小鼠生物型沙眼衣原体C. muridarum 1＆#215;104 IFU阴道接种于C57B6背景雌性小鼠,取感染后阴道拭子做沙眼衣原体培养,计算IFU,监测小鼠感染和病原体清除情况;80 d后处死小鼠,检测子宫输卵管病理改变;ELISA检测感染过程中小鼠生殖道促炎性细胞因子IL-1α、IL-6、MIP-2和TNF-α产生情况。小鼠感染在第3至第15天维持较高水平,然后病原体被逐渐清除,整个病程约3~5周;病理检测显示子宫输卵有严重炎症、管腔扩张积水,狭窄等;于感染后第3天检测到局部IL-1α、IL-6、MIP-2分泌,第7天达高峰,然后逐渐下降至正常水平（ IL-6于11 d恢复正常,IL-1α和 MIP-2于15 d恢复正常）。 TNF-α仅在第7天检测到高水平表达。相对于TNF-α和IL-6,IL-1α和MIP-2维持时间较长。成功建立沙眼衣原体感染小鼠生殖道模型,沙眼衣原体急性感染可诱导小鼠生殖道局部分泌IL-1α、IL-6、MIP-2和TNF-α。     

沙眼衣原体持续感染对Hela细胞TLR4/IL-6/STAT3信号通路的影响

目的：分析沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）持续感染对靶细胞TLR4/IL-6/STAT3信号通路的影响.方法：利用Hela细胞分别建立Ct急性感染及持续性感染模型,通过qRT-PCR、ELISA等方法比较Ct感染过程中靶细胞TLR4、STAT3、IL-6转录水平及细胞因子IL-6分泌量的变化.结果：Ct感染后靶细胞TLR4、IL-6、STAT3转录水平及细胞因子IL-6分泌量均呈现时间相关性上调,且持续性感染状态下比急性感染状态下的上调更为显著;IL-6/STAT3的表达量与TLR4转录水平正相关.结论：Ct持续感染过程中TLR4 的持续活化可大幅上调IL-6/STAT3信号通路表达,可能参与了Ct持续感染后慢性炎性损伤过程.     

斯氏油脂酵母基因组Fosmid文库的构建及降解百草枯氮次级代谢相关基因的筛选

斯氏油脂酵母在以百草枯作为唯一氮源的培养基中能降解百草枯,但其机制尚不清楚。为分离鉴定斯氏油脂酵母中降解百草枯的相关基因,本研究通过构建斯氏油脂酵母的Fosmid文库,用百草枯作为筛选标记,成功筛选到7个百草枯抗性的大肠杆菌克隆。对阳性克隆插入片段进行了测序分析,并对真核基因进行注释。结果在插入片段中发现了nmrA基因及氮代谢相关基因,nmrA是真菌在限氮的条件下才激活的氮代谢相关基因,能调控激活下游的次级氮代谢基因家族,分解那些不常见的氮源。这提示斯氏油脂酵母可能也具有氮的次级代谢调控机制,在百草枯作为唯一氮源的环境下斯氏油脂酵母能激活次级氮代谢相关基因,分解代谢百草枯。     

抗动脉粥样硬化核酸疫苗安全性的初步研究

目的：研究抗动脉粥样硬化核酸疫苗的安全性。方法：观察该质粒在小鼠组织中的分布和急性毒性,井在正常给药的情况下对新西兰大白兔进行6个月毒性试验。采用肌肉注射20μg/只和100μg/只,用P（温法检测外源基因在小鼠组织的分布和存留时间;同样采用肌肉注射,对最高剂量达到到50kg/kg体重的小鼠进行急性毒性试验。结果：实验证明该核酸疫苗在注射部位可存留时间为8周,其他组织如心、肝、脾、肺、肾、脑和生殖器官也有低水平分布,急毒试验显示,在剂量达到有效荆量的60倍的情况下,无可观察到的毒性反应发生,小鼠血液学和生化指标亦无异常;新西兰大白兔毒性观察,体内生化指标以及解剖学研究结果表明,该药无可观察到的毒性反应发生。结论：该核酸疫苗无可观察到的明显毒性反应,安全性良好。