棕色固氮菌nifS敲除菌株的构建

从Azotobacter vinelandii中通过PCR扩增了5’和3’端分别缺失264bp和261bp的nifS'片段,克隆至载体pUCl8,形成重组质粒pUCS,再通过同源重组的方法,将pUCS插入Azotobacter vinelandii的nifS中,形成够阻断突变体SUl,经Southern杂交和：PCR扩增,证明所得确为nifS阻断突变株。SUl在外加氮源的BBGN培养基中能够快速生长,但在Burk's无氮培养基中,生长却极其缓慢,表明,nifS基因的破坏,已造成SU1的固氮能力接近完全丧失。该突变体的成功构建,为进一步从中纯化固氮酶两组分,研究nifS对固氮酶结构及功能的影响及iscS与nifS之间的关系奠定了良好的基础。     

果蝇中Ecp蛋白的表达、纯化与抗体制备

获得特异性抗Ecp多克隆抗体,为进一步研究ecp的功能奠定基础。利用特异引物,通过RT-PCR扩增出编码Ecp蛋白的全长cDNA,克隆至谷胱甘肽S转移酶融合蛋白表达载体pGEX-4T-1(His)6C中,转染大肠杆菌DH 5α,经诱导表达后,利用谷胱甘肽琼脂糖珠从细胞裂解物中特异吸附融合蛋白,经凝血酶裂解,释放出Ecp蛋白,再经Ni-NTA亲和层析,最终获得高纯度的Ecp蛋白。用纯化的Ecp蛋白免疫新西兰家兔,亲和层析纯化抗Ecp抗体。利用该抗体进行的Western Blot结果表明：Ecp蛋白在野生型黑腹果蝇胚胎、三龄幼虫神经系统、成虫、成虫头部组织中均有明显表达,提示ecp可能是一个重要的管家基因。     

含锰固氮酶组分Ⅰ蛋白的纯化和特性

棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW3能在无Mo的无氨培养基中固氮生长,低浓度的Mn对UW3突变种生长有促进作用,从在Mn中生长的UW3菌体中分离得到的部分纯固氮酶组分Ⅰ蛋白含量有Mn和Fe原子（Fe/Mo/Mn为10．41：0．19：1．00）并有OP MoFe蛋白一半的还原乙炔和质子的活性。这种蛋白的吸收光谱和圆二色谱与MoFe蛋白存在明显的差异,含Mn蛋白的亚基分子量都与MoFe蛋白的α亚基相近。初步结果表明,这种含Mn蛋白可胡是一种固氮酶组分Ⅰ蛋白。     

棕色固氮菌nifS敲除菌株的构建*

从Azotobacter vinelandii中通过PCR扩增了5’和3’端分别缺失264bp和261bp的nifS′片段,克隆至载体pUC18,形成重组质粒pUCS,再通过同源重组的方法,将pUCS插入Azoto-bacter vinelandii的nifS中,形成nifS阻断突变体SU1,经Southern杂交和PCR扩增,证明所得确为nifS阻断突变株。SU1在外加氮源的BBGN培养基中能够快速生长,但在Burk's无氮培养基中,生长却极其缓慢     

锰,铬和钼重组液及其与部分缺金属原子簇钼铁蛋白重组的比较研究

棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉ）钼铁蛋白经邻菲口罗啉和Ｏ２处理后,缺失一部分ＦｅＭｏｃｏ和Ｐｃｌｕｓｔｅｒ,并失去大部分活性。高柠檬酸铁、Ｎａ２Ｓ和二硫苏糖醇（ＤＴＴ）分别与Ｋ２ＣｒＯ４、ＫＭｎＯ４和Ｎａ２ＭｏＯ４按一定比例混合的具有不同颜色的重组液,均可显著激活失活的钼铁蛋白;然而,除ＤＴＴ可略提高失活蛋白的活性外,其它化合物或缺一、二种化合物的混合液均无激活能力。含９９Ｍｏ重组液与失活蛋白重组后的微分扰动角关联测定显示,该蛋白中的４１％的９９Ｍｏ的状态与克氏肺炎杆菌９９ＭｏＦｅ蛋白中的９９Ｍｏ相似,表明这种激活主要是以金属原子簇含量恢复为基础的。由此可推论出,含Ｍｎ或Ｃｒ的重组液,通过与失活钼铁蛋白重组得到含Ｍｎ或Ｃｒ的固氮酶是可能的。