FTL-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建小鼠铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)真核表达载体并检测其表达。[方法]利用PCR扩增技术得到小鼠560 bp的FTL基因编码序列,将此序列插入到含有增强型绿色荧光基因EGFP的真核表达载体PEGFP/N1多克隆位点区域中的限制内切酶HindⅢ和Bam HⅠ之间,得到真核表达载体m FTL-PEGFP/N1。经酶切和测序鉴定后,将构建成功的m FTL-PEGFP/N1及其对照空载体PEGFP/N1分别转染到小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞中,提取蛋白后利用免疫印迹技术检测细胞中带有PEGFP标签的FTL蛋白的表达。[结果]新构建的m FTL-PEGFP/N1重组质粒经酶切鉴定得到预期片段,进一步的测序结果显示所构建的重组质粒中插入的小鼠FTL基因的c DNA序列正确。[结论]利用分子克隆技术获得了带有绿色荧光蛋白标签的小鼠铁蛋白轻链真核表达载体m FTL-PEGFP/N1,并在细胞中表达良好。     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建北大核心

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

人自噬相关基因5真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建带Flag标签的自噬相关基因5(ATG5)的真核表达载体,获得Flag-ATG5融合蛋白。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增人ATG5编码序列,将其插入pc DNA3-Flag载体,转染人胚肾293T细胞后,Western印迹检测其表达情况;将该重组质粒与ATG12表达质粒共转染293T细胞,通过免疫共沉淀法检测2个蛋白的相互作用。结果:Flag-ATG5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后融合蛋白获得表达,其相对分子质量约33×103;Flag-ATG5可与Myc-ATG12结合。结论:构建了带Flag标签的人ATG5真核表达载体,为进一步研究ATG5在自噬中的功能奠定了基础。     

铁蛋白轻链真核表达载体的构建

目的:为进一步研究铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的表达对细胞内信号转导途径的影响提供平台。方法:利用PCR扩增技术得到小鼠552 bp的FTL基因编码序列,并在基因的C端引入Flag标签,将此序列插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点区域中限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ之间,得到带有Flag标签的FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。分别经酶切和测序鉴定。用脂质体lipofectamineTM2000将构建成功的pcDNA3-FTL-Flag及其对照空载体pcDNA3分别转染到RAW264.7细胞中,提取蛋白后利用Western blot方法检测细胞中带有Flag标签的FTL蛋白表达。结果:重组质粒酶切鉴定得到预期片段,测序结果显示所构建的小鼠FTL基因的cDNA序列正确,并在细胞内检测到分子量约为21kDa的蛋白的强烈表达信号。结论:实验成功构建小鼠FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。     

携带Flag标签的人自噬相关蛋白4B的真核表达及功能鉴定

目的:构建携带Flag标签的人自噬相关基因4B(ATG4B)的真核表达质粒,获得Flag-ATG4B融合蛋白,并检测其与LC3的相互作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增获得ATG4B序列,并将其插入pc DNA3.0-Flag载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用Western印迹检测融合蛋白的表达,用免疫共沉淀检测ATG4B与LC3的相互作用。结果:菌液PCR和重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,免疫共沉淀结果表明表达的ATG4B能与LC3结合。结论:构建了pc DNA3.0-Flag-ATG4B真核表达质粒,表达的ATG4B蛋白对LC3的切割至关重要,这为进一步研究ATG4B在自噬过程中的作用奠定了基础     

人MDM2基因真核表达载体的构建及其与p53的相互作用

目的:构建带Flag标签的MDM2真核表达载体,并检测MDM2与p53的相互作用。方法:从人乳腺文库中PCR扩增MDM2编码序列,将其插入pcDNA3.0-Flag载体,转染293T细胞后用Western印迹检测其在293T细胞中的表达,并通过免疫共沉淀实验检测MDM2与p53的相互作用。结果:双酶切和测序结果表明,Flag-MDM2真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达;免疫共沉淀实验证明Flag-MDM2与p53存在相互作用。结论:构建了带Flag标签的人MDM2真核表达载体,并检测了MDM2与p53之间的相互作用,为研究MDM2的功能奠定了基础。     

SUSD2基因真核表达载体构建及其在H322细胞中表达

[目的]构建SUSD2基因真核表达载体,并观察其在真核细胞H322细胞中的表达。[方法]从H322细胞中提取总RNA并逆转录为c DNA,采用PCR技术扩增出含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的人SUSD2基因片段,以质粒pc DNA3.1为表达载体,构建重组质粒pc DNA3.1-SUSD2。采用PCR、双酶切鉴定以及测序验证c DNA片段大小和序列正确。将重组载体pc DNA3.1-SUSD2转染H322细胞,Western Blot法检测SUSD2蛋白的表达。[结果]PCR、双酶切鉴定以及测序结果显示pc DNA3.1-SUSD2包含大小、序列正确的SUSD2片段;Western Blot结果显示SUSD2蛋白在转染pc DNA3.1-SUSD2的H322细胞中表达高于转染pc DNA3.1的H322细胞。[结论]成功获得SUSD2基因全长序列,并成功构建SUSD2基因真核表达载体,有效地在非小细胞肺癌细胞株H322中表达,为进一步研究该基因功能及机制奠定了基础。     

人白细胞介素-36受体拮抗剂基因的克隆及序列分析

[目的]构建人白细胞介素-36受体拮抗剂(interleukin-36 receptor antagonist,IL-36Ra)的真核表达载体,并对其基因全长编码区进行分析。[方法]提取总RNA,逆转录出IL-36Ra c DNA序列。设计人IL-36Ra基因的上游引物和下游引物。利用热启动PCR扩增目的基因,将扩增出的IL-36Ra基因编码区通过限制性内切酶酶切后,把酶切的目的片段与载体pc DNA3.1连接,转化到感受态细胞大肠杆菌DH5α中。通过氨苄青霉素抗性筛选、双酶切及菌落PCR鉴定,最后选取阳性克隆进行测序。[结果]重组载体pc DNA3.1-h IL-36Ra经菌落PCR和酶切鉴定,最后通过序列分析证实,其序列与Gen Bank中数据一致。[结论]人IL-36Ra基因的重组真核表达载体pc DNA3.1-h IL-36Ra的成功构建,为进一步研究IL-36Ra在免疫性疾病中的作用奠定了实验基础。     

稳定表达p120ctn的人肺腺癌A549细胞株的构建

目的:构建稳定表达p120ctn的A549细胞株,以研究p120ctn蛋白在肺癌发生和转移过程中的作用。方法:通过分子克隆,将pc DNA3.1多克隆位点插入Flag标签的编码序列,得到pc DNA.Flag表达载体。然后PCR扩增p120ctn的编码序列,插入Flag标签下游,构建pc DNA.Flag-p120ctn质粒,筛选阳性克隆并进行酶切及测序鉴定。利用脂质体Lipofectamine 2000将pc DNA.Flag-p120ctn质粒转染到肺癌细胞A549中,通过G418筛选得到稳定转染细胞株,免疫印迹法检测p120ctn的表达。结果:本文构建了融合有Flag标签的p120ctn真核表达载体并转染到A549中,免疫印迹结果表明p120ctn蛋白在A549细胞中高效的表达。结论:本文成功构建了稳定高表达p120ctn的A549细胞模型,为深入研究p120ctn在肺癌的发生和转移过程中的作用奠定了基础。     

小鼠IL-27真核表达载体的构建及其在RAW264.7 细胞中的表达

目的:构建小鼠白介素27(Interleukin 27,IL-27)单链融合基因的真核表达载体并检验其在RAW264.7细胞中的表达情况。方法:提取小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出小鼠EBI3和p28 c DNA。采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3和p28基因片段,构建小鼠IL-27单链融合基因(mouse single chain IL-27,msc IL-27),并将其克隆至pc DNA3.1(+)载体。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体,将重组质粒pc DNA3.1-IL-27通过脂质体转染法转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果:测序分析表明,小鼠IL-27单链融合基因中EBI3、linker和p28的连接顺序、方向及碱基序列与预期相符。在转染后的RAW264.7细胞中检测到了小鼠IL-27 m RNA的表达。结论:成功构建了小鼠IL-27单链融合基因及其真核表达载体,并在RAW264.7细胞中实现表达,为进一步探讨IL-27的生物学功能奠定了基础。     

NAMPT 真核表达载体构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的:为探索烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)对肝癌细胞增殖的影响,构建pc DNA3.1(+)-NAMPT真核表达载体。方法:以正常肝细胞的c DNA为模板,通过PCR扩增得到NAMPT全长序列,经酶切、连接、转化等步骤构建真核表达载体。重组质粒经酶切鉴定及测序验证后,用脂质体转染法转染肝癌细胞MHCC-97H和正常肝细胞HL-7702,免疫印迹检测NAMPT蛋白表达情况;WST实验检测过表达NAMPT后对MHCC-97H和HL-7702增殖的影响。结果:真核表达载体pc DNA3.1(+)-NAMPT构建成功,转染HL-7702和MHCC-97H细胞后,NAMPT蛋白表达水平较空白组分别升高了83%和180%;过表达NAMPT可促进细胞增殖,而抑制NAMPT活性后,细胞增殖被抑制(P0.001)。结论:成功构建了真核表达载体pc DNA3.1(+)-NAMPT,并发现NAMPT表达水平与细胞增殖密切相关,为进一步探索NAMPT表达在肝癌细胞增殖的分子作用机制和筛选新的肿瘤药物靶点奠定了基础。     

磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体,并瞬时转染胃癌耐药细胞,对其生物学功能进行初步检测。方法:以带有pc DNA3.0-Flag标签的Akt1质粒为模板,采用重组PCR技术扩增得到Akt1(T308A)(苏氨酸突变成丙氨酸)、Akt1(T308E)(苏氨酸突变成谷氨酸)位点突变编码区序列,将其插入pc DNA3.0-Flag载体,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其表达情况;将突变质粒与空载体分别转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP,通过Western印迹和实时定量PCR检测Notch1蛋白和m RNA水平的变化,通过CCK-8法检测对耐药细胞生长曲线的影响。结果:双酶切和测序结果表明Akt1(T308A)、Akt1(T308E)的真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP后,利用实时定量PCR和Western印迹证明去磷酸化Akt1(T308A)可抑制Notch1的转录和蛋白水平,模拟持续磷酸化Akt1(T308E)升高Notch1的转录和蛋白表达;细胞生长曲线结果显示,转染Akt1(T308A)较空载体耐药细胞生长慢,而Akt1(T308E)促进耐药细胞生长。结论:PI3K/Akt与Notch1信号通路的激活在胃癌耐药的发生、发展过程中发挥重要作用。     

人Smurf1基因真核表达质粒的构建和表达

[目的]构建人Smurf1基因的真核表达载体并检测其表达和细胞亚定位。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增Smurf1基因的ORF序列,将其插入到带Flag标签的p CMV5真核表达载体,插入位点为限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间。酶切并测序鉴定该质粒的正确性。将成功构建的质粒Flag-Smurf1转染HEK-293T细胞和Hela细胞,Western Blotting检测Smurf1蛋白的表达情况;转染Mv. 1. Lu细胞,免疫荧光检测Smurf1蛋白在细胞中的亚定位。[结果]成功扩增出Smurf1基因的ORF序列;连入p CMV5中获得了质粒Flag-Smurf1;酶切鉴定得到2. 2 kb大小的片段,测序结果显示连入的是Smurf1基因的c DNA序列正确。Western Blotting结果显示该质粒可在HEK-293T细胞和Hela细胞中表达,表达大小约为80 k Da,符合预期。免疫荧光实验结果显示过表达的Smurf1主要定位在细胞膜上。[结论]成功构建了带Flag标签的人Smurf1基因的真核表达质粒,该质粒可在细胞中顺利表达。     

利用CRISPR/Cas系统构建在XRCC6内源基因插入Flag标签序列的HeLa细胞系

目的:利用CRISPR/Cas系统在XRCC6基因5′端插入Flag标签序列,筛选XRCC6-Flag稳定表达的宫颈癌细胞(He La)株。方法:根据Gen Bank中XRCC6基因序列,设计XRCC6基因敲入的g RNA序列,构建入p Cas-Guide载体中,获得p Cas-XRCC6载体;设计XRCC6基因的同源臂序列,利用搭桥PCR方法将同源臂和Flag标签序列作为模板进行扩增,得到供体DNA片段,并将其克隆到p Back Zero-T表达载体上,获得p XRCC6-Donor载体;将上述2个载体共转染He La细胞,采用PCR、Western印迹等方法检测和筛选Flag标签序列插入XRCC6基因5′端的细胞株。结果:构建了p Cas-XRCC6和p XRCC6-Donor载体,筛选获得3株XRCC6-Flag稳定表达细胞株。结论:构建了XRCC6-Flag稳定细胞株,为研究XRCC6基因及其蛋白产物的生物学功能奠定了基础。     

pcDNA3.1-Pax6载体的构建及其对胶质瘤细胞增殖的影响

目的:构建pc DNA3.1-Pax6过表达质粒并观察其对胶质瘤U251细胞增殖的影响。方法:以K562细胞c DNA为模版,采用RT-PCR的方法扩增Pax6基因,将扩增产物酶切回收后与同样酶切回收的真核表达载体pc DNA3.1连接、转化,构建pc DNA3.1-Pax6重组质粒,再经菌落PCR、酶切及测序鉴定重组质粒;利用脂质体lipofectamine 2000转染重组质粒至U251细胞。Real-time PCR检测Pax6 mRNA的表达水平,Western blot检测PAX6蛋白的表达,MTT法检测U251细胞增殖。结果:PCR扩增获得长度为1 131 bp的阳性产物,经pc DNA3.1真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pc DNA3.1-Pax6构建成功;Real-time PCR结果显示,Pax6过表达后的U251细胞Pax6 mRNA表达水平明显高于正常对照组;Western blot结果显示,PAX6蛋白表达亦明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P0.05);MTT结果显示,与正常对照组细胞比较,转染pc DNA3.1-Pax6组的细胞,细胞增殖能力明显降低,差异亦具有统计学意义(P0.05)。结论:成功构建人Pax6基因的pc DNA3.1-Pax6重组质粒,过表达Pax6基因抑制U251细胞的增殖。     

Flag标签MORC2-677丝氨酸位点突变载体构建及表达

构建Flag标签pcDNA3.1-MORC2的677丝氨酸位点突变重组质粒并完成在SGC-7901细胞中表达,更好地研究677丝氨酸位点所发生的功能.首先,构建含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点Flag标签的pcDNA3.1空载体;再以含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的pcDNA3.1A-MORC2-WT野生型质粒为模板,在S677突变位点两侧设计重叠突变引物,进行三轮重叠延伸PCR完成定点突变,获得MORC2全长编码序列的S677位点的定点突变体载体(pcDNA3.1A-MORC2-S677A/S677E);再通过KpnⅠ和XhoⅠ酶切把pcDNA3.1A-MORC2-WT/S677A/S677E各载体定向克隆到已构建好的pcDNA3.1-Flag空载体中,酶切鉴定及测序正确后,转染到SGC-7901细胞中,利用Flag–标签抗体,Western blot检测其各突变载体的表达.成功构建了人Flag标签MORC2全长编码序列S677位点突变体真核表达载体并在SGC-7901细胞中获得带Flag标签融合蛋白表达产物,为进一步研究MORC2的功能奠定了基础.     

小鼠GP73蛋白真核表达质粒的构建及其对mTOR转录水平的影响

目的:构建小鼠高尔基蛋白73(m GP73)的真核表达质粒,转染HEK293T细胞株验证重组质粒活性,并检测m GP73过表达情况下对小鼠肝癌细胞中mTOR m RNA水平的影响。方法:以实验室保存的H22小鼠肝癌细胞c DNA文库为模板,采用PCR技术扩增获得m GP73序列,将其插入pc DNA3.1-Flag-vector载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用蛋白免疫印迹检测融合蛋白的表达,并用q PCR检测在GP73过表达情况下H22细胞中mTOR转录水平的变化。结果:菌液PCR、重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,蛋白免疫印迹表明m GP73蛋白在HEK293T细胞中获得表达,q PCR结果表明在m GP73过表达时mTOR的转录水平随之上升。结论:构建了pc DNA3.1-Flag-m GP73真核表达质粒,m GP73 m RNA过表达时mTOR的m RNA水平也上升,这为进一步研究m GP73在小鼠肝脏肿瘤转移过程中的作用奠定了基础。     

人磷酸葡萄糖变位酶5对肝癌细胞生长和迁移的影响

目的:构建带有Flag标签的人磷酸葡萄糖变位酶5(PGM5)基因的真核表达载体,研究PGM5对肝癌细胞生长、迁移的影响。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增PGM5基因编码序列,酶切后插入pcDNA3.0-Flag载体;将空载体与重组质粒分别转染293T细胞,Western印迹检测PGM5的表达;CCK8生长曲线实验研究PGM5对肝癌细胞生长的影响,细胞划痕实验检测PGM5对肝癌细胞迁移的影响。结果:双酶切及测序结果显示pcDNA3.0-Flag-PGM5真核表达载体构建成功;Western印迹表明PGM5在293T细胞中获得表达;生长曲线和划痕实验显示PGM5可以显著抑制肝癌细胞的生长和迁移。结论:构建了pcDNA3.0-Flag-PGM5表达载体,并发现PGM5可以抑制肝癌细胞生长和迁移,为进一步研究PGM5在癌症发生发展中的作用奠定了基础。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。